奇異變形桿菌的系統(tǒng)發(fā)育分析、在雛雞體內(nèi)分布規(guī)律及亞單位疫苗研制.pdf

1、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis，Pmirabilis)屬于腸桿菌科變形桿菌屬，廣泛分布于自然界中，常見于污水、土壤和堆肥中，是一種常見的腐生性條件致病菌(HoenigerJ.F.M.，1964)。在人類，本菌是引起食物中毒的主要元兇之一，近年來變形桿菌屬食物中毒在細(xì)菌性食物中毒中更是占有越來越大的比率，并呈逐年上升趨勢(shì)。而本菌在國(guó)內(nèi)引起肉仔雞發(fā)病，則在1996年才有報(bào)道，自此不斷有關(guān)于本菌感染雛雞的報(bào)道出現(xiàn)。奇異變形桿

2、菌主要引起禽類腹瀉、肢腿癱瘓、敗血癥、腦軟化等。各種日齡的雞群均可感染本病，但以4周齡以內(nèi)的雛雞最易感，本病既可水平傳播，又能垂直傳播，很容易造成爆發(fā)性流行疾病，對(duì)于種禽和肉雞養(yǎng)殖業(yè)具有潛在的巨大威脅（江益民，1996）。因此，為了探究奇異變形桿菌的致病機(jī)制及防治方法，本文從以下三個(gè)方面對(duì)其展開研究。
　　 1.16S-23S rRNA基因間隔序列PCR及RFLP對(duì)奇異變形桿菌分離株的鑒別與系統(tǒng)發(fā)育分析
　　 根據(jù)臨床常

3、見致病菌16S-23S rRNA基因間隔序列(ISR)兩端的16S及23S rRNA保守序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增的通用引物，對(duì)9株奇異變形桿菌和6株相近菌株應(yīng)用通用引物PCR擴(kuò)增16S-23S rRNA ISR序列。通過PCR長(zhǎng)度多態(tài)性比較、RFLP分析以及部分序列測(cè)序比較，分析鑒別奇異變形桿菌。結(jié)果顯示，PCR長(zhǎng)度多態(tài)性可以將奇異變形桿菌同其余菌種進(jìn)行區(qū)分;RFLP分析可以將所有試驗(yàn)菌種進(jìn)行區(qū)分;部分序列測(cè)序可以對(duì)奇異變形桿菌進(jìn)行分型。由此

4、表明，16S-23S rRNA ISR序列PCR及RFLP分析可以簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的鑒定奇異變形桿菌。
　　 2.奇異變形桿菌在雛雞體內(nèi)的分布規(guī)律及動(dòng)態(tài)變化
　　 應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室保存的奇異變形桿菌Q1株攻毒3日齡雛雞，建立奇異變形桿菌病動(dòng)物模型。分別于攻毒后8h、16h、1d、2d、3d、7d，采集動(dòng)物的心、肝、脾、肺、腎、法氏囊、肌胃、十二指腸、小腦等器官并迅速放入4％多聚甲醛中固定，然后建立免疫酶組織化學(xué)方法檢測(cè)固定的

5、組織器官;同時(shí)采集動(dòng)物外周血涂板進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。結(jié)果表明，奇異變形桿菌在組織器官中的定植時(shí)間順序?yàn)?十二指腸、小腦、法氏囊、脾＞肝、肺＞腎;在1 d-3d，細(xì)菌分布最廣，但在小腦和十二指腸分布最多;在7d，幸存動(dòng)物中僅在十二指腸和小腦檢測(cè)到少量細(xì)菌;細(xì)菌主要定植于實(shí)質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞中;所有血液涂板均檢測(cè)到攻毒菌。這說明，十二指腸和小腦是本菌主要的靶器官，實(shí)質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞是本菌主要入侵的細(xì)胞，細(xì)菌可以進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，造成菌血癥或敗血癥。以上

6、結(jié)果說明了奇異變形桿菌在雛雞體內(nèi)的定植分布規(guī)律，初步解釋了本菌引起疾病的發(fā)病機(jī)制，為研究其預(yù)防治療方法奠定了基礎(chǔ)。
　　 3.泰山松花粉多糖增強(qiáng)雞奇異變形桿菌亞單位疫苗的免疫效果
　　 分別制備泰山松花粉多糖、白油、蜂膠三種佐劑，然后將其分別與奇異變形桿菌的外膜蛋白混合研制成亞單位疫苗（Ⅰ-Ⅴ分別為白油佐劑疫苗、蜂膠佐劑疫苗、泰山松花粉多糖佐劑疫苗、無佐劑疫苗和生理鹽水）。將300只1日齡雛雞隨機(jī)分為5組，每組60只，分

7、別于3、7、12日齡采用不同疫苗頸部皮下免疫雛雞。在首免后3、7、14、21、28、35、42和49 d，分別檢測(cè)外周血抗體滴度、白介素2(IL-2)含量和T淋巴細(xì)胞增殖率和小腸SIgA含量。在三免后7d，采用Q1株奇異變形桿菌攻毒，檢測(cè)每組疫苗對(duì)雛雞的保護(hù)力。結(jié)果表明，Ⅲ組疫苗的保護(hù)率最高;另外，本組的抗體滴度、IL-2和SIgA含量以及T淋巴細(xì)胞增殖率顯著升高，并且在多數(shù)檢測(cè)日期顯著高于其它組。這說明，泰山松花粉多糖可以顯著增強(qiáng)奇異