核定位碳酸酐酶6B通過PRMT5表觀機(jī)制促進(jìn)天然免疫白細(xì)胞介素12產(chǎn)生的研究.pdf

1、正常的免疫應(yīng)答反應(yīng)對于機(jī)體的自我保護(hù)至關(guān)重要。機(jī)體通過天然免疫應(yīng)答識別入侵病原體（病毒、細(xì)菌及真菌）或者細(xì)胞內(nèi)危險信號模式分子，激活細(xì)胞引起炎癥反應(yīng)在內(nèi)的一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，啟動天然免疫反應(yīng)及后期的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。這個免疫應(yīng)答過程由許多免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子共同參與。在參與免疫應(yīng)答反應(yīng)的多種分子中，白細(xì)胞介素12（interleukin12，IL-12）是一種關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子，它主要由活化的巨噬細(xì)胞(macrophages)和樹

2、突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)產(chǎn)生，并進(jìn)一步誘導(dǎo)Th1輔助性淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(Natural Killer cells，NK cells)分泌干擾素γ（interferonγ，IFN-γ），從而保護(hù)機(jī)體抵抗病原體感染，特別是胞內(nèi)細(xì)菌的感染。由此可見，IL-12通過其自身作用將機(jī)體天然免疫屏障和后續(xù)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答相互關(guān)聯(lián)，是天然免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁分子。
　　IL-12由IL-12p35和IL-12p4

3、0兩個亞基組成。IL-12家族共有3個成員，除了IL-12之外，另一個成員是白細(xì)胞介素23(interleukin23，IL-23)，由與IL-12有相同的亞基IL-12p40和IL-23p19組成;還有一個成員是白細(xì)胞介素27(interleukin27，IL-27)，由EB病毒誘導(dǎo)基因3(Epstein-Barr virus-induced gene3，EBI3)和IL-27p28組成。IL-12在免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，然而

4、，有關(guān)IL-12表達(dá)調(diào)控的機(jī)制目前尚未完全闡明。通過本研究首次表明IL-12可以被碳酸酐酶6B(carbonic anhydrase6B type，Car6-b，編碼CA-ⅥB)調(diào)控表達(dá)的新機(jī)制。
　　E-selectin（由Sele編碼）是血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附因子，介導(dǎo)白細(xì)胞的粘附和遷移。在前期研究工作發(fā)現(xiàn)E-selectin不僅介導(dǎo)白細(xì)胞的游出，還通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞中干擾素γ受體β亞基(IFNγR2)在細(xì)胞膜的表達(dá)，參與巨噬細(xì)胞的

5、活化過程。通過對Sele敲除小鼠（Sele-/-）和對照組小鼠(Sele+/+)腹腔注射李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)后，取體內(nèi)刺激第三天的腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行芯片分析發(fā)現(xiàn)，Car6在Sele-/-腹腔巨噬細(xì)胞中的表達(dá)顯著下降，因此提示Car6在天然免疫反應(yīng)中可能具有一定的功能。
　　碳酸酐酶(carbonic anhydrases，CAs)廣泛存在于哺乳動物中，屬于α-碳酸酐酶。CAs是含鋅離子(Zn

6、2+)的金屬酶，可以催化二氧化碳(carbon dioxide)發(fā)生水合反應(yīng)，對于pH調(diào)控和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有重要作用。目前，鑒定出13種具有碳酸酐酶活性的同工酶，其中，只有CA-Ⅵ是分泌型表達(dá)的碳酸酐酶，分泌到唾液和乳汁中。CA-Ⅵ蛋白有兩種亞型:一種是分泌型的A型Car6（Car6-a，編碼CA-ⅥA），另一種是定位在細(xì)胞內(nèi)的B型Car6（Car6-b，編碼CA-ⅥB）。目前為止，該家族成員是否參與天然免疫應(yīng)答反應(yīng)尚沒有報道。
　　

7、首先對Car6在免疫細(xì)胞中的表達(dá)譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)只有Car6-b表達(dá)在免疫細(xì)胞中，特別是在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)。為了進(jìn)一步研究Car6-b在天然免疫反應(yīng)中的作用，首先在體外培養(yǎng)的原代巨噬細(xì)胞中使用siRNA干擾技術(shù)下調(diào)Car6-b的表達(dá)，之后分別用李斯特菌或者脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激，發(fā)現(xiàn)IL-12的表達(dá)量在Car6-b下調(diào)表達(dá)后的細(xì)胞內(nèi)顯著降低。隨后用CRISPR-Cas9(Clustered Regul

8、arly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein9)體系構(gòu)建Car6敲除的小鼠，通過體內(nèi)感染李斯特菌模型，發(fā)現(xiàn)Car6表達(dá)缺失后，IL-12的產(chǎn)生受到顯著抑制，小鼠清除李斯特菌能力也顯著降低，導(dǎo)致Car6敲除小鼠在感染李斯特菌后生存率顯著低于野生型小鼠。進(jìn)一步探討了Car6如何特異性調(diào)控IL-12的表達(dá)，結(jié)果表明，核定位的CA-ⅥB通過與蛋白精氨酸甲

9、基化轉(zhuǎn)移酶5(protein arginine N-methyltransferase5，PRMT5)相互作用，從而減少Il12啟動子區(qū)組蛋白H3第8位精氨酸對稱性二甲基化(H3R8me2s)修飾，進(jìn)而促進(jìn)Il12啟動子區(qū)染色質(zhì)的開放狀態(tài)，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子c-Rel與Il12b啟動子區(qū)的結(jié)合，最終選擇性促進(jìn)IL-12的表達(dá)。
　　的研究揭示了一種全新的IL-12表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，即碳酸酐酶6B可以通過與PRMT5相互作用以表觀修飾的機(jī)制