基于免疫脂質體的生物傳感器在體外診斷中研究及其應用.pdf

1、體外診斷(In vitro diagnosis，IVD)是一種在人體之外檢驗樣本（血液、體液、組織）而進行疾病或身體功能的診斷方法。生物傳感器(Biosensor)是在生命科學和信息科學之間發(fā)展起來的一類特殊傳感器，在多種學科的融合和交叉下形成的，包括醫(yī)學、納米技術、信息學和化學等等，在食品檢測、活體成像、臨床應用上有巨大的作用，是目前國內外關注的熱點研究。目前臨床上對于各類標記物的檢測方法普遍存在操作繁瑣、檢測時間長、需要特殊場地、大

2、型設備及專業(yè)人員等因素制約，因此開發(fā)高靈敏度、簡便、快速、適用于復雜環(huán)境并利于臨床推廣的生物傳感技術迫在眉睫。蛋白質是生物體中必不可少的生物分子，涉及廣泛的生物學功能。其異常表達是常與疾病聯(lián)系在一起，對于疾病的診斷、治療和預后有著重要的意義。在蛋白質檢測中，實現(xiàn)微量、動態(tài)、實時且快速，是目前廣大科研工作人員的關注點。納米技術在生物領域形成了納米生物技術，將納米材料應用于生物傳感器可以很大程度的提高傳感器的性能。脂質體作為新型納米診斷顆粒

3、，既可以鏈接不同的配體如抗原、抗體、生物素、羧基等，又可以包封不同的標記物，檢測模式多種多樣?？梢宰鳛樾盘栟D導、信號轉化、信號放大的良好載體，具有廣泛的應用前景，在高靈敏度和多種檢測方法聯(lián)合應用上有其優(yōu)越性。本論文以臨床常用肝癌、胰腺癌及炎癥生物標記物為蛋白檢測模型，與環(huán)介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、手持熒光檢測儀及微流控芯片等技術相結合，構建了一系列基于免疫脂質

4、體納米顆粒的生物傳感器，并應用與臨床標本，大大提高了檢測靈敏度及即時檢測(Point-of-care testing，POCT)技術。
　　第一部分 基于生物熒光脂質體和便攜式ATP熒光檢測儀在肝癌診斷中的應用
　　本部分，我們研發(fā)了一種超靈敏的基于磁性-生物熒光脂質體的生物傳感器，使用便攜式三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)熒光檢測儀用于血液中蛋白質生物標志物的POCT檢測。在這項研究中，我

5、們使用甲胎蛋白(Alpha fetoprotein，AFP，肝癌相關的蛋白質生物標志物)作為模型蛋白。羧基磁珠偶聯(lián)單克隆抗體捕獲樣本中的靶蛋白，隨后與標記有生物熒光脂質體的多克隆抗體結合，形成磁珠-靶蛋白-脂質體復合物。脂質體破膜后，包裹在內腔的ATP釋放，可用便攜式熒光儀進行讀數(shù)。在此過程中，我們使用便攜式磁珠分離筆來簡化步驟。相對光單位(Relative light units,RLUs)與AFP濃度在0.05和1000ng/mL之

6、間呈線性相關，最低檢測限(Limit of detection，LOD)為0.01ng/mL。當RLUs大于300，即AFP濃度大于25ng/mL時即有診斷意義。我們稱這種基于生物熒光脂質體和便攜式ATP熒光的檢測技術為LBM(The bioluminescent nanoliposomes conjugated to magnetic particles)。此方法對AFP顯示出高度特異性，在25ng/mL濃度下與其他蛋白質無反應。通過

7、LBM方法對40個臨床樣品(20例AFP陽性和20例AFP陰性)進行實際應用測試，結果與羅氏電化學發(fā)光測定的結果一致，相對偏差小于10％。這種LBM技術在血液中的成功應用為其他生物標志物檢測提供了的新的思路，也顯示出了其在臨床診斷的POCT中的巨大潛力。
　　第二部分 基于生物素化脂質體和LAMP的生物傳感器在胰腺癌診斷中的應用
　　隨著蛋白質組學的發(fā)展和痕量蛋白質生物標志物的不斷發(fā)現(xiàn)，準確定量低豐度蛋白，特別是尿液中的蛋白

8、質對臨床診斷具有重要意義。在這部分，我們研發(fā)了一種新的基于納米生物素脂質體結合LAMP的超靈敏檢測蛋白標記物技術。選擇REG1A（一種可用于胰腺導管腺癌診斷的尿生物標志物）為蛋白模型。我們稱這種檢測方法為LI-LAMP(Nano-biotinylated liposome-based loop-mediated isothermal amplification)。此方法將DNA作為報告分子，包封于三代脂質體內，并在表面標記生物素化配體，

9、結合核酸擴增產生三倍信號放大。此方法用于REG1A診斷特異性高，線性檢測范圍為1fg/mL至1μg/mL，LOD為1fg/mL，蛋白回收率為89％-130％。實際樣品應用于經(jīng)典ELISA試劑盒方法結果一致，相對偏差不超過10％。LI-LAMP使用生物素化脂質體，可將保存期延長，通過生物素-親和素橋聯(lián)系統(tǒng)進一步信號放大，并可以很好地與現(xiàn)有的商業(yè)試劑盒對接，其超高的靈敏度為其他低豐度的蛋白標志物提供了可行的檢測方法。
　　第三部分 微

10、流控芯片和量子點脂質體用于炎癥標志物定量的iPOCT檢測
　　本部分，我們采用脂質體與量子點相結合，將油性量子點變?yōu)樗苄缘募{米量子點脂質體微球，對蛋白標志物進行特異性的標記及識別，在微流控芯片上iPOCT實現(xiàn)快速、靈敏的診斷。我們命名此種方法為LQC(Liposome encapsulated quantum dots combined with microfluidic chip for iPOCT)。在這項研究中，我們使用降

11、鈣素原（Procalcitonin，PCT，炎癥蛋白質生物標志物）作為模型蛋白。將多克隆抗體和羊抗鼠抗體按照一定的濃度和體積鋪設于微流控芯片以形成檢測線和控制線，結合區(qū)預先鋪設與單克隆抗體偶聯(lián)的量子點脂質體，將待測樣本加樣到結合區(qū)后，在毛細力的驅動下，進入反應區(qū)。結合自行研制的便攜紫外激發(fā)設備和手機應用程序進行讀數(shù)分析，并對可行性進行驗證。RGB傳感器檢測可知，G通道和PCT濃度在0-10ng/mL之間呈線性，LOD為0.5ng/mL。