用于活體斑馬魚全腦成像的光片照明顯微鏡研究.pdf

1、腦作為動(dòng)物體最重要的器官之一，其龐雜的結(jié)構(gòu)以及豐富的功能長(zhǎng)久以來一直是人們研究腦的主要對(duì)象和關(guān)鍵問題。光學(xué)顯微成像方法作為近年來突飛猛進(jìn)的手段，已經(jīng)被逐漸廣泛地應(yīng)用于腦科學(xué)研究中。在眾多的光學(xué)顯微成像方法中，光片照明顯微成像術(shù)近年發(fā)展迅速，由于其具有的三維細(xì)胞水平分辨率，快速面成像以及低光漂白等特性，在腦成像領(lǐng)域嶄露頭角，尤其是在透活體斑馬魚腦成像方面受到了廣泛的關(guān)注。
　　然而，斑馬魚全腦成像要求光學(xué)顯微鏡能夠在覆蓋全腦的三維成

2、像過程中獲取每個(gè)單細(xì)胞在秒量級(jí)時(shí)間尺度下的神經(jīng)活動(dòng)，這對(duì)傳統(tǒng)光片照明顯微鏡提出了重大的挑戰(zhàn)，而對(duì)于該問題的攻克也是國際相關(guān)課題組研究的重點(diǎn)問題。本文基于光片照明的活體斑馬魚全腦顯微成像系統(tǒng)展開研究，提出了雙縫共聚焦光片照明成像方法，建立了斑馬魚全腦神經(jīng)活動(dòng)與行為的同步記錄的成像方法。
　　本研究首先發(fā)展了基于柱透鏡的靜態(tài)光片照明成像系統(tǒng)，通過對(duì)系統(tǒng)成像性能的理論分析與實(shí)驗(yàn)，對(duì)光片照明顯微成像方法的物理成像過程進(jìn)行了分析。通過軟硬件

3、設(shè)計(jì)以及光路搭建，得到橫向分辨率1.1μm、縱向分辨率5.9μm，視場(chǎng)800μm，成像速度15幀每秒的成像系統(tǒng)。采用系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了斑馬魚全腦結(jié)構(gòu)成像與三維重建研究。結(jié)合斑馬魚成像的需求對(duì)該方法的信噪比以及三維成像速度方面的不足進(jìn)行了討論。
　　基于對(duì)以上光片照明顯微成像方法成像信噪比的理論分析，結(jié)合新型成像器件的成像原理，提出通過雙光束掃描與雙縫探測(cè)的光片照明顯微成像方法用于斑馬魚全腦功能成像。通過理論計(jì)算以及實(shí)驗(yàn)研究，證明該方法能夠

4、在快速成像的前提下，實(shí)現(xiàn)了成像信噪比的有效提升。同時(shí)，系統(tǒng)研究了狹縫共聚焦成像過程中信噪比隨狹縫寬度變化的物理過程。經(jīng)過系統(tǒng)搭建以及活體斑馬魚腦成像的研究，證明了該方法具有分辨精細(xì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及快速神經(jīng)活動(dòng)的優(yōu)勢(shì)，為全腦神經(jīng)功能成像研究提供了有效手段。
　　在已有研究的基礎(chǔ)上，發(fā)展了用于自然狀態(tài)下斑馬魚全腦三維神經(jīng)功能成像的光片照明成像方法，通過動(dòng)態(tài)光片的三維掃描實(shí)現(xiàn)了快速三維數(shù)據(jù)的獲取。系統(tǒng)的活體斑馬魚成像實(shí)驗(yàn)證明了系統(tǒng)具有1秒每

5、個(gè)三維數(shù)據(jù)集（1500μm×1500μm×200μm）的單細(xì)胞分辨高速熒光成像能力。進(jìn)一步地，為了實(shí)現(xiàn)斑馬魚從單細(xì)胞水平的神經(jīng)活動(dòng)到行為的全面成像研究，發(fā)展了基于微鏡陣列的同步光刺激與行為記錄方法，實(shí)現(xiàn)了與三維快速腦成像同步的空間光刺激以及全局的行為記錄。通過搭建系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了斑馬魚在外界刺激下行為及全腦神經(jīng)功能同步成像，證明了系統(tǒng)在單細(xì)胞活動(dòng)到生物整體行為的全面研究方面的能力。
　　通過本文的研究，有希望為光學(xué)手段在生物體的全腦神