采用LAMP法和FQ-PCR法檢測痰液標本中的肺炎鏈球菌.pdf

1、目的： 1.了解LAMP(環(huán)介導恒溫擴增)方法的技術原理，操作步驟。對環(huán)介導恒溫擴增方法的各組分進行試驗優(yōu)化，找到該方法的最佳組分濃度和反應溫度。 2.通過比較LAMP法，PCR法及傳統(tǒng)檢測方法對臨床痰液標本中肺炎鏈球菌檢測的結果，了解LAMP法的特點。評估LAMP方法應用于臨床診斷，并成為一種臨床快速檢測痰液標本中肺炎鏈球菌的新方法的可能性。 3.采用熒光定量PCR技術檢測痰液中的肺炎鏈球菌。獲得該方法的標準曲

2、線，得到痰液中肺炎鏈球菌DNA的濃度，建立一種快速檢測痰液標本中肺炎鏈球菌的方法。 4.采用熒光定量PCR技術獲得痰液標本中的肺炎鏈球菌的拷貝濃度，評估病人痰液中的肺炎鏈球菌DNA濃度與該菌是否為導致疾病的致病菌之間的可能關系，并以此來為臨床是否對細菌室報送的肺炎鏈球菌陽性結果采取措施提供指導。 方法： 1.改變各種LAMP檢測的相關試劑成分和反應溫度，摸索最佳的濃度和比例以及反應溫度。 2.采用LAMP

3、法對多種標準菌株進行檢測，驗證該方法的特異性。 3.將肺炎鏈球菌標準菌株制得的總DNA進行系列梯度稀釋，分別采用LAMP法和PCR法進行檢測，比較兩種方法的靈敏度。 4.采用LAMP法和PCR法對經(jīng)過傳統(tǒng)方法檢測出肺炎鏈球菌的痰液和未檢出肺炎鏈球菌的痰液標本各41例標本進行檢測。觀察LAMP方法檢測臨床痰液標本中的肺炎鏈球菌的效果。 5.對已知濃度的DNA標準品進行梯度稀釋，使用熒光定量PCR商品試劑盒分別對其進

4、行擴增，制得標準曲線，檢測標本中的肺炎鏈球菌DNA濃度。 6.將痰液標本中的肺炎鏈球菌拷貝濃度與被檢測病人臨床診斷內(nèi)容相結合，制作ROC曲線，判斷肺炎鏈球菌的DNA濃度與病人標本中的肺炎鏈球菌的來源的可能關系。 結果： 1.通過對LAMP體系中的各組分進行優(yōu)化，找到該反應針對肺炎鏈球菌檢測的最佳各組分濃度和反應溫度。包括1.6μmol/L的引物FIP和BIP，0.2μmol/L的引物F3和B3，8U Bst DN

5、A聚合酶(附帶含2 mM MgSO4的緩沖液)，1.0mM(each) dNTP，20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L KCl，10mmol/L(NH4)2SO4，6mmol/L MgSO4，0.1％ Triton X-100，0.8mol/L Betaine和5μl已制得的模板液，最后補雙蒸水至50μl。反應條件為63℃60min進行擴增，80℃2min滅活酶的活性。 2.通過對9種非肺炎鏈球菌和2種肺炎鏈球菌

6、的LAMP檢測表明，非肺炎鏈球菌菌株不能通過該方法被檢出，而肺炎鏈球菌則能夠被檢出。 3.對由標準菌株制得的已知濃度的細菌總DNA模板液進行梯度稀釋后，進行LAMP法和PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，LAMP法在35min和60min時檢測lytA基因的最低菌液濃度分別為103cfu/ml和102cfu/ml，而PCR法在30個循環(huán)的時間里檢測lytA基因的最低菌液濃度為104cfu/ml。LAMP法(60min)比PCR法(30個循環(huán))敏感

7、性高二個數(shù)量級。 4.本研究共檢測了82例痰液標本，其中41例用傳統(tǒng)檢測方法檢出肺炎鏈球菌的標本用LAMP法和PCR方法也都能夠檢出。另外41例用傳統(tǒng)檢測方法沒有檢測到肺炎鏈球菌的標本中PCR法檢測到了6例陽性，LAMP法檢測到了13例陽性，x2=4.2312，P>0.1，三種檢測方法沒有顯著差別。 5.對PCR產(chǎn)物進行純化和濃度檢測，將已知濃度的產(chǎn)物進行梯度稀釋后分別進行PCR反應，得到了一條PCR擴增的標準曲線。

8、 6.通過對病人的臨床診斷和熒光定量PCR擴增的結果進行比較發(fā)現(xiàn)，在痰液肺炎鏈球菌拷貝濃度為103-109/ml之間時，病人呼吸道疾病的病情存在較大的輕重差異。通過對結果的ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，最佳的截斷值是2.95×105/ml，在此時其靈敏度是85.7％，特異性是76.9％。 結論： 1.環(huán)介導恒溫擴增方法檢測肺炎鏈球菌的方法具有可行性，而且該方法的特異性和靈敏度均較好，在痰液標本制得的總DNA溶液復雜成分條件下也

9、能夠取得成功。 2.我們將LAMP法、PCR法及傳統(tǒng)方法對82例痰液標本中肺炎鏈球菌的檢測結果進行比較后發(fā)現(xiàn)，三種方法沒有顯著性差別。但是LAMP方法具有的檢測快速，成本低等優(yōu)點較其它兩種方法仍有很大的優(yōu)勢?？梢詫Υ朔N方法進一步研究完善，以滿足真正用于臨床應用的要求。 3.采用熒光定量PCR對痰液標本進行肺炎鏈球菌定量檢測的嘗試被證明是可行的。在對PCR體系和溫度進行充分優(yōu)化，并對引物的特異性進行充分驗證的情況下，該方法