膽道感染細(xì)菌與機(jī)體相互作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文通過對(duì)引起膽道感染的大腸桿菌P菌毛的表達(dá)及papG粘附素基因的檢測(cè)，來明確膽道感染大腸桿菌的另一個(gè)特點(diǎn)一粘附特性；通過對(duì)急性重癥膽管炎大鼠模型多器官NF-kB、TLR-4、TLR-2的表達(dá)，來明確機(jī)體對(duì)病原微生物的先天和后天免疫防御反應(yīng)，探討急性重癥膽管炎時(shí)多器官功能不全的機(jī)理，并對(duì)從感染的始動(dòng)環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)，減輕全身炎癥反應(yīng)綜合癥和多器官功能不全提供理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法： 一、實(shí)驗(yàn)對(duì)象 1.收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附

2、屬盛京醫(yī)院臨床微生物室保留的從膽道感染病人膽汁內(nèi)培養(yǎng)出的大腸桿菌菌株34例及從健康志愿者糞便中分離出的大腸桿菌菌株8例，分別進(jìn)行甘露醇抗性血凝試驗(yàn)(MRHA)，并應(yīng)用PCR法擴(kuò)增所有菌株3型papG粘附素基因并進(jìn)行分析比較。 2.Wistar大鼠，160-220g，雌雄不限。制成急性重癥膽管炎大鼠模型(膽道梗阻+E.coli)作為實(shí)驗(yàn)組(36例)，單純膽道梗阻模型(膽道梗阻+Saline)作為對(duì)照組(18例)。 二、標(biāo)本

3、采集 1.采集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組不同時(shí)點(diǎn)(1h、6h和24h)大鼠血標(biāo)本、肝臟組織標(biāo)本、肺臟組織標(biāo)本和小腸組織標(biāo)本。 2.一部分組織標(biāo)本立即置入-80℃保存，待行RT-PCR和Western-Blot檢測(cè)；另一部分立即置入5％多聚甲醛溶液中固定，待行組織病理和免疫組織化學(xué)檢測(cè)。 三、檢測(cè)指標(biāo) 1.P菌毛表達(dá)檢測(cè)：應(yīng)用甘露糖抗性血凝試驗(yàn)(MRHA)對(duì)42株大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)，凡凝集當(dāng)時(shí)或4℃過夜，觀察凝集反應(yīng)呈≥

4、“++”者，判定為陽(yáng)性。 2.papG粘附素基因檢測(cè)：應(yīng)用PCR擴(kuò)增，檢測(cè)42株大腸桿菌粘附素等位基因papGⅠ、papGⅡ、papGⅢ的表達(dá)情況。 3.血清炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子檢測(cè)：應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組不同時(shí)點(diǎn)血中“TNF-α、IL-10、IL-4濃度，表明全身炎癥反應(yīng)強(qiáng)度。 4.肝臟、肺臟、回腸組織病理學(xué)檢測(cè)：檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組不同時(shí)點(diǎn)肝臟、肺臟、回腸組織病理學(xué)改變，表明組織病理學(xué)改變程度。

5、 5.NF-kB蛋白表達(dá)檢測(cè)：應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)在肝臟、肺臟及小腸組織中的定位表達(dá)情況，應(yīng)用Western-Blot方法檢測(cè)NF-kB在肝臟組織中的定量表達(dá)情況。 6.NF-kB mRNA表達(dá)檢測(cè)：應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)NF-kB mRNA在肝臟、肺臟及小腸組織中的定量表達(dá)情況。 7.TLR-4、TLR-2蛋白表達(dá)檢測(cè)：應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)在肝臟、肺臟及小腸組織中的定位表達(dá)情況，應(yīng)用Wegem-Blot方

6、法檢測(cè)TLR-4、TLR-2在肝臟組織中的定量表達(dá)情況。 8.TLR-4、TLR-2 mRNA表達(dá)檢測(cè)：應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)TLR-4、TLR-2mRNA在肝臟、肺臟及小腸組織中的定量表達(dá)情況。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.P菌毛表達(dá)檢測(cè)：膽道內(nèi)大腸桿菌P菌毛表達(dá)陽(yáng)性率為47.06％(16/34)，顯著高于腸道內(nèi)大腸桿菌P菌毛表達(dá)陽(yáng)性率0％(0/8)(p<0.05)。 2.papG粘附素基因檢測(cè)：膽道內(nèi)大腸桿菌粘

7、附素等位基因papGⅠ、papGⅡ、papGⅢ的表達(dá)陽(yáng)性率分別為67.65％， 44.12％， 82.35％，其中papGⅢ顯著高于腸道內(nèi)大腸桿菌的表達(dá)陽(yáng)性率37.5％(p<0.05)。 3.血清炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)組外周血中TNF-α、IL-4水平術(shù)后1h即顯著升高，6h達(dá)到峰值，均顯著高于對(duì)照組，24h有所下降。IL-10濃度在術(shù)后1h即達(dá)到峰值，并顯著高于對(duì)照組，此后隨時(shí)間變化逐漸下降。 4.肝臟、肺臟、回

8、腸組織病理學(xué)檢測(cè)：肝臟實(shí)驗(yàn)組1h組可見肝細(xì)胞濁腫，肝竇、肝細(xì)胞周圍及匯管區(qū)有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。6h組可見肝細(xì)胞濁腫明顯，排列疏松紊亂，明顯脂肪變性，有散在的點(diǎn)狀壞死灶，壞死灶內(nèi)較大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；12h組病理改變同6h組，程度更嚴(yán)重，壞死灶較多，呈大片狀，膿腫形成，內(nèi)有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。肺臟實(shí)驗(yàn)組1h組肺泡壁增厚，間質(zhì)滲出，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。6h組可見肺內(nèi)出血，肺間質(zhì)滲出增多，肺實(shí)變加重，較大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；12h組病理改變同6h組，程度更嚴(yán)重，

9、可見有肺出血及膿腫、壞死灶形成?；啬c病理形態(tài)學(xué)改變不大，實(shí)驗(yàn)組24h組可見小腸粘膜少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。 5.NF-kB蛋白表達(dá)檢測(cè)：免疫組化發(fā)現(xiàn)重癥膽管炎大鼠術(shù)后1h、6h、24h可見肝細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞、腸粘膜上皮細(xì)胞內(nèi)有棕色顆粒均勻分布于細(xì)胞漿，部分位于細(xì)胞核內(nèi)，其中以肝細(xì)胞6h組最為明顯。對(duì)照組大鼠相應(yīng)組織則為陰性或僅有少量陽(yáng)性染色細(xì)胞。Western-Blot方法檢測(cè)到重癥膽管炎和對(duì)照組大鼠術(shù)后肝組織NF-kB蛋白的表達(dá)，與相

10、應(yīng)mRNA表達(dá)規(guī)律一致：重癥膽管炎大鼠NF-kB 在術(shù)后 6h顯著高于對(duì)照組(11805.67±2410.69 vs9888.67±244.85，p=0.026)。 6.NF-kB mRNA表達(dá)檢測(cè)：重癥膽管炎大鼠術(shù)后1h肝組織NF-kB mRNA即升高，6h達(dá)到高峰并顯著高于對(duì)照組(1.95±1.67 vs 0.75±0.22，p=0.001)，24h下降。肺組織NF-kB mRNA表達(dá)與肝一致。術(shù)后1h NF-kB mRNA

11、即升高，6h達(dá)到高峰并顯著高于對(duì)照組(1.69±0.36 vs 0.58±0.19，p=0.033)，24h下降。重癥膽管炎大鼠術(shù)后1h腸組織NF-kB mRNA即升高(0.38±0.16 vs 0.25±0.04，p=0.001)，6h達(dá)到高峰(0.86±0.34 VS 0.57±0.05，p=0.003)，24h下降(0.63±0.24 vs 0.25±0.05，p=0.011)，均顯著高于對(duì)照組。 7.TLR-4、TLR-

12、2蛋白表達(dá)檢測(cè)：應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)對(duì)照組1h、6h、24h組肝臟、肺臟及小腸未見或僅有少量TLR-4和TLR-2表達(dá)。急性重癥膽管炎大鼠1h即可在肝臟、肺臟中表達(dá)，6h組表達(dá)最強(qiáng)，24h表達(dá)減弱。TLR-4和TLR-2表達(dá)均位于胞漿內(nèi)。Western-Blot方法檢測(cè)到重癥膽管炎和對(duì)照組大鼠術(shù)后肝組織TLR-2的表達(dá)隨時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸增強(qiáng)，6h達(dá)到高峰(11278.50±1066.73 vs 8434±470.57，p=0.0

13、3)，24h略有下降但顯著高于對(duì)照組(10964.67 ±883.33 vs 8288.83±212.53，p=0.008)。重癥膽管炎和對(duì)照組大鼠術(shù)后肝組織TLR-4的表達(dá)與TLR-2一致，1h增高(8613.33±1999.22vs 6406.50±224.98，p=0.05)，6h達(dá)到峰值(11209.33 ±1271.09 vs 7287.33±240.78 p：0.12)，24h略有下降。 8.TLR-4、TLR-2

14、mRNA表達(dá)檢測(cè)：應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)到重癥膽管炎大鼠術(shù)后肝組織TLR-4mRNA術(shù)后1h即開始升高，6h達(dá)峰并顯著高于對(duì)照組(14.80±2.58 VS 9.30±1.08 p=0.002)，24h開始下降。肺組織TLR-4mRNA術(shù)后1h即開始升高，6h達(dá)峰，24h后輕度下降(8.02±1.32 VS 4.67±O．53p=0.037)。腸組織TLR-4mRNA表達(dá)與肝、肺組織相似，即術(shù)后1h即開始升高(8.25±2.14vs5

15、.01 ±0.68 p=0.05)，6h達(dá)峰，24h開始下降，但顯著高于對(duì)照組(7.89±3.14 VS 6.96±1.07 p=0.001)。重癥膽管炎大鼠術(shù)后肝組織TLR-2mRNA術(shù)后1h即開始升高(1.51±0.83 VS 1.18±O．25 p=0.002)，6h達(dá)峰，24h下降。肺組織TLR-2mRNA術(shù)后1h即開始升高，(10.13±5.20 VS5.54±1.12 p=0.001)，6h達(dá)峰(11.59±5.11 vs6

16、.89 ±1.07 p=0.001)， 24h后下降。腸組織TLR-2mRNA表達(dá)術(shù)后1h小時(shí)即開始升高，6h達(dá)峰(4.78±1.83vs2.05±1.40 p=0.002)，24h開始下降，但仍顯著高于對(duì)照組(4.52±1.30 VS 2.59±1.36 p=0.004)。 結(jié)論： 1.致膽道感染大腸桿菌P菌毛表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于正常腸道內(nèi)大腸桿菌； 2.致膽道感染大腸桿菌papG粘附素基因表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于正常