融合表達(dá)禽致病性大腸桿菌fima-ompC基因及微皺褶細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞靶向肽重組乳酸菌的鑒定及免疫學(xué)評(píng)價(jià).pdf

1、禽大腸桿菌病是由致病性禽大腸桿菌(APEC)引發(fā)的一種可導(dǎo)致雞胚和成年雞死亡的傳染病。該病可引發(fā)禽類的急性致死性腸炎、腹膜炎、輸卵管炎、亞急性心包炎、大腸桿菌性肉芽腫以及膿毒敗血癥。該病是一種常見(jiàn)的禽病，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。雖然某些血清型的APEC并不引起發(fā)病，但多數(shù)APEC均能引發(fā)腸道外感染。其中，O1、O2和O78是引發(fā)大腸桿菌病的主要血清型。APEC可通過(guò)呼吸道和胃腸道進(jìn)入血液造成系統(tǒng)感染。
　　近期研究表明，由

2、于APEC血清型眾多，抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，大腸桿菌病很難治愈。因此，通過(guò)抗原刺激機(jī)體天然黏膜免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)機(jī)體黏膜免疫顯得尤為重要。本論文在含有錨定蛋白PgsA的乳酸菌L.casei(Lc393)和L.saerimneri(M11)中融合表達(dá)O78血清型APEC的fimA、ompC基因以及微褶皺細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞靶向肽(M-DC)基因，通過(guò)加入T7g10增強(qiáng)子以及M-DC靶向肽提高目的蛋白的表達(dá)量，增強(qiáng)目的蛋白的免疫活性。以O(shè)78型大腸桿菌基因組

3、為模板，分別用特異性引物A1,A2，C1和C2擴(kuò)增fimA基因(528bp)和ompC基因(1074 bp)。通過(guò)融合PCR鏈接fimA和ompC基因，構(gòu)建重組載體pMD19-T-OmpC-fimA。雙酶切OmpC-fimA后(Apa1和Sac1)鏈接M-DC，構(gòu)建表達(dá)載體pPG-T7g10-PPT-OmpC-fimA和pPG-T7g10-PPT-OmpC-fimA-M-DC。將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入L.casei(Lc393)和L.saer

4、imneri(M11)中，成功構(gòu)建四株重組菌pPG-T7g10-PPT-OmpC-fimA/M11(POF/M11)、pPG-T7g10-PPT-OmpC-fimA-M-DC/M-11(POFm-dc/M11)、pPG-T7g10-PPT-OmpC-fimA/Lc393(POF/Lc393)和ppG-T7g10-PPT-OmpC-fimA-M-DC/Lc393(POFm-dc/Lc393)。Western blot結(jié)果表明分子量分別為1

5、01KDa和104.5KDa的外源蛋白成功獲得表達(dá)。重組菌在低PH值、高膽汁鹽濃度的強(qiáng)刺激條件下定植于腸道并從小腸黏膜層排出病原體。
　　本研究在不同時(shí)間間隔檢測(cè)重組菌在回腸、盲腸和結(jié)腸的定植能力和吸附能力，在強(qiáng)刺激條件下檢測(cè)表型特征。結(jié)果表明，四株重組菌均能吸附于腸道上皮細(xì)胞，相比于POF/Lc393和POF/M11，POFm-dc/Lc393和POFm-dc/M11顯著提高了雞抵抗腸道疾病病原的免疫力，并且顯著提高了雞的生長(zhǎng)水

6、平。同時(shí)，本研究檢測(cè)了重組菌POFm-dc/Lc393和POFm-dc/M11在不同段小腸的生理化學(xué)特性、黏附能力和定植能力。重組菌作為口服疫苗具有良好的免疫原性，能夠?qū)C(jī)體產(chǎn)生有效的免疫保護(hù);并且作為益生菌和治療制劑，能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能。并且，L.casei重組菌的融合蛋白表達(dá)量及其黏附能力均高于L.saerimnerL重組菌。表達(dá)靶向肽和融合蛋白的重組乳酸菌是未來(lái)開(kāi)發(fā)針對(duì)大腸桿菌病有效口服疫苗的候選菌株，同時(shí)為研究重組乳酸菌的治療