IL-8介導血管平滑肌細胞遷移機制及G31P的作用初探.pdf

1、目的:動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)導致的心腦血管疾病是人類健康的最大殺手,在我國的發(fā)病率逐年升高。近年來的研究表明AS是一種炎癥性疾病,大量的炎癥細胞和炎性因子伴隨在其發(fā)生和發(fā)展過程的始終。炎癥細胞參與AS表現(xiàn)為在損傷部位有大量炎癥細胞的粘附、浸潤,并且釋放大量的炎性因子,趨化白細胞穿過血管內(nèi)膜,誘導平滑肌細胞表型改變,繼而遷移進入內(nèi)膜并進行增殖。這些細胞進入內(nèi)膜后,開始吞噬脂質(zhì)形成泡沫細胞,加速AS的發(fā)展。趨化

2、因子是一類具有趨化作用的小分子量分泌型蛋白,可以誘導白細胞進入血管內(nèi)膜,在AS中發(fā)揮重要作用。白細胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)是一種單核/巨噬細胞分泌的多肽,通過與其受體CXCR1/CXCR2結(jié)合從而啟動中性粒細胞趨化反應。IL-8還能夠誘導人主動脈血管平滑肌細胞遷移和增殖;并且可以促進AS中新生血管形成,但其具體機制尚不清楚。抑制IL-8與其受體結(jié)合為治療AS提供了新的思路。G31P是通過對人IL-8基因的定點突

3、變,篩選的出高親和力,無活性的人IL-8類似物。通過實驗證實了G31P可以高效的親和CXCR1/CXCR2,對與中性粒細胞相關(guān)的感染治療上有明顯的療效。G31P對中性粒細胞CXCR1/CXCR2的有效抑制作用能否發(fā)生在血管平滑肌細胞中尚未有研究。
　　 方法:(1)利用RT-PCR的方法檢測A7r5細胞中是否有IL-8的受體之一CXCR2的表達;(2)利用Boyden Chamber法觀察IL-8和G31P對A7r5細胞遷移的影

4、響;(3)利用劃痕法和Boyden Chamber法觀察G31P在IL-8誘導A7r5細胞遷移過程中的影響;(4)利用細胞免疫熒光方法觀察細胞骨架變化情況;(5)利用鈣離子熒光探針Fluo-3 AM檢測IL-8與G31P對A7r5細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。
　　 結(jié)果:(1)RT-PCR結(jié)果顯示A7r5細胞中有CXCR2的表達;(2)IL-8誘導A7r5細胞遷移實驗結(jié)果顯示,隨著IL-8濃度的增加,細胞遷移數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢,IL-8

5、濃度為20ng/ml、50ng/ml兩組的細胞遷移數(shù)較其它各組有統(tǒng)計學意義,但這兩組之間差異無統(tǒng)計學意義。隨著G31P濃度的增加,遷移的細胞數(shù)并未發(fā)生明顯變化,各組間的差異無統(tǒng)計學意義。(4)劃痕和遷移實驗結(jié)果顯示了細胞平均遷移距離與相對遷移數(shù)量兩項統(tǒng)計值的變化情況,只用G31P處理的陰性對照組與空白對照組比較,兩項統(tǒng)計值的變化均無統(tǒng)計學意義。只用IL-8誘導的陽性對照組與空白對照組比較,兩項統(tǒng)計值的變化均有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。

6、G31P抑制組與空白對照和G31P陰性對照組比較,兩項統(tǒng)計值的變化無統(tǒng)計學意義;與IL-8陽性對照比較,兩項統(tǒng)計值的變化有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。(5)免疫熒光實驗結(jié)果顯示,隨著IL-8濃度增加,細胞偽足伸出明顯增加,呈劑量依賴趨勢。與未用G31P預處理、IL-8終濃度為20ng/ml組的細胞相比,在用G31P預處理后再用IL-8刺激,可觀察到細胞偽足的伸出不明顯。(6)細胞內(nèi)鈣離子濃度測定結(jié)果顯示,隨著IL-8濃度的增加(0-10

7、0ng/ml)細胞內(nèi)鈣離子的熒光強度逐漸增加,呈現(xiàn)劑量依賴趨勢,與對照組相比有統(tǒng)計學意義。與用同樣濃度的IL-8刺激組相比,用G31P預處理的細胞、再用IL-8刺激后,其細胞內(nèi)鈣離子的熒光強度變?nèi)?有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論:(1)IL-8可以誘導A7r5細胞的遷移、細胞偽足伸出、細胞內(nèi)鈣離子濃度升高,具有劑量依賴性。(2)G31P可以有效抑制IL-8對A7r5細胞的誘導作用。(3)IL-8對A7r5細胞的誘導作用可能通過調(diào)節(jié)細