阿魏酸通過(guò)調(diào)節(jié)鈉離子通道(ENaC)介導(dǎo)骨形成的研究.pdf

1、目的：觀察當(dāng)歸的水溶性單體成分阿魏酸（FA）對(duì)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞（Ob）成骨功能的影響，并探討其作用機(jī)制，為活血化瘀中藥用于骨質(zhì)疏松的防治提供理論依據(jù)。
　　 方法：以新生SD乳鼠頭蓋骨原代培養(yǎng)的Ob為研究對(duì)象，取第三代細(xì)胞進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)，96孔板每孔加細(xì)胞100μl，細(xì)胞密度為1×104/mL，條件培養(yǎng)基中先加入不同濃度（0.001-1000mg.L-1）的FA進(jìn)行藥物有效濃度篩選，然后選擇FA的終濃度分別為7.8、31.2、1

2、25、500mg.L-1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，各濃度組設(shè)三復(fù)孔，應(yīng)用CCK-8法、堿性磷酸酶(ALP）法、茜素紅染色方法觀察FA對(duì)體外培養(yǎng)的Ob的增殖、分化及礦化的影響，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化；Elisa檢測(cè)FA作用后Ob內(nèi) cGMP的表達(dá), siRNA PKGⅡ沉默技術(shù)的應(yīng)用，RT-PCR檢測(cè)PKGⅠα、PKGⅠβ、PKGⅡ、ENaCα、ENaCγ等基因的表達(dá)，并檢測(cè)FA對(duì)成骨相關(guān)指標(biāo)Collagen-Ⅰ、ALP、Osteopontin

3、等的表達(dá)。
　　 結(jié)果：（1）藥效評(píng)價(jià)：FA在0.01-100mg.L-1范圍內(nèi)可以促進(jìn)Ob的增值（P<0.05），至1000mg.L-1時(shí)，其抑制Ob的增值（P<0.05），在1-1000mg.L-1范圍內(nèi)可以促進(jìn)Ob的分化（P<0.05），故選擇FA 7.8-500mg.L-1四個(gè)濃度組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；與對(duì)照組比較，四個(gè)濃度組均具有刺激Ob增殖的作用（P<0.05），組間比較，只有500mg.L-1濃度組與其他組比較存在顯著性增加

4、（P<0.01），流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期表明其可以增加G2/M期細(xì)胞含量；同時(shí)在7.8-500mg.L-1濃度內(nèi)，F(xiàn)A可以提高ALP活性（P<0.05），四個(gè)濃度組中，除了31.2與125 mg.L-1濃度之間沒(méi)有差異外，其他各組間都存在顯著性差異（P<0.01），隨著濃度的增加，ALP增加；茜素紅染色顯示，7.8-250mg.L-1的FA可以增加鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量，其中7.8 mg.L-1濃度組的數(shù)量最多，而到500mg.L-1濃度時(shí)，F(xiàn)

5、A則不促進(jìn)鈣化結(jié)節(jié)的形成。RT-PCR的結(jié)果表明，F(xiàn)A在7.8-500mg.L-1內(nèi)促進(jìn)成骨相關(guān)基因Collagen-Ⅰ、AKP、Osteopotin等的表達(dá)（P<0.05），但未見(jiàn)劑量依賴關(guān)系。
　　 （2）作用機(jī)制研究：FA在7.8-500mg.L-1濃度范圍內(nèi)可以促進(jìn)Ob內(nèi) cGMP的的分泌（P<0.01），除了 125與500mg.L-1濃度之間沒(méi)有差異外，7.8、31.2、125mg.L-1濃度間呈劑量依賴性增加（P<

6、0.01，P<0.05）；RT-PCR的結(jié)果表明，F(xiàn)A在7.8-500mg.L-1濃度范圍內(nèi)均可以促進(jìn)cGMP信號(hào)通路的下游分子PKGⅡ基因的表達(dá)（P<0.05），然而對(duì)PKGⅠα、PKGⅠβ等基因的表達(dá)無(wú)明顯作用。同時(shí)ENaCα、ENaCγ基因的表達(dá)增加（P<0.05）；基因沉默實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染 siRNA PKGⅡ的Ob，ENaCαmRNA表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05），而FA加上轉(zhuǎn)染 siRNA PKGⅡ組的Ob