大鼠急性缺血性腎損傷對(duì)肺的影響.pdf

1、在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，急性腎損傷(acute kidney injury，AKK)是十分常見、復(fù)雜的臨床問題之一。危重病人中有30％的病人發(fā)生急性腎損傷。有研究顯示重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)病人有5-6％的病人發(fā)生急性腎損并且需要腎替代治療。雖然透析技術(shù)及高級(jí)治療方法不斷改進(jìn)，但急性腎損傷的死亡率仍居高不下，達(dá)到了40-60％。在本質(zhì)上，腎功能衰竭本身通常并不是AKI的死因，而是心源性和非心源性急性肺損傷(ALI)導(dǎo)致了AKI的高死亡率。有研究顯示，

2、ICU中AKI常常合并ALI，尤其是急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)，這類患者的死亡率接近80％。
　　 腫瘤壞死因子α(TNF-α)是炎癥反應(yīng)過程中最早出現(xiàn)且最重要的炎癥介質(zhì)之一。TNF-α、白細(xì)胞介素6(IL-6)等多種細(xì)胞因子協(xié)同構(gòu)成炎性細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，參與創(chuàng)傷和多種炎癥性疾病的病理過程。幾個(gè)不同的動(dòng)物模型所致的ALI/ARDS中，TNF-α、IL-6的含量均表現(xiàn)為升高。有研究證實(shí)在急性腎損傷的早期患者體內(nèi)炎癥介質(zhì)發(fā)生了改變，這可

3、能是急性腎損傷引起遠(yuǎn)隔器官損傷的機(jī)制。另外，近年研究證實(shí)水通道蛋白1(AQP1)及α肺上皮鈉通道蛋白(α-ENac)在維持肺泡腔內(nèi)的液體平衡具有重要作用，在急性肺損傷時(shí)水通道蛋白1(AQP1)及鈉通道蛋白表達(dá)的下降促進(jìn)了肺損傷的發(fā)生。
　　 肺血管內(nèi)皮細(xì)胞襯于血管壁內(nèi)表面，是血管壁與血液間的分界細(xì)胞，其形態(tài)結(jié)構(gòu)受損或功能改變導(dǎo)致血管內(nèi)皮屏障功能的損害，促進(jìn)急性肺損傷的發(fā)生、發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞骨架與血管內(nèi)皮通透性的調(diào)節(jié)密切

4、相關(guān)，對(duì)于維持內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能有重要意義。纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)是細(xì)胞骨架中的主要收縮蛋白，增加其含量可以使內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增加，導(dǎo)致血管屏障功能的損害。熱休克蛋白27(heat shock protein27，HSP27)作為一種重要的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，在細(xì)胞內(nèi)可被p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號(hào)途徑磷酸化，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白聚合/解聚過程，使肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架發(fā)生重組，促進(jìn)急性肺損傷的發(fā)生。
　　

5、我們擬通過雙腎動(dòng)靜脈央閉建立急性缺血性腎損傷大鼠模型，觀察大鼠肺病理及病理生理的變化。與內(nèi)毒素所致的肺損傷相比，二者是否存在區(qū)別。明確上皮細(xì)胞鈉通道和水通道蛋白1在急性腎損傷所致肺損傷的作用。觀察p38MAPK-HSP27信號(hào)通路在急性腎損傷誘發(fā)急性肺損傷的過程中的變化規(guī)律。并與內(nèi)毒素所致肺損傷相比較，該信號(hào)通路在肺損傷的發(fā)病過程中機(jī)制上是否相同。為急性腎損傷繼發(fā)急性肺損傷的的預(yù)防、早期診治提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。
　　 方法：

6、r>　　 1、動(dòng)物模型制備和分組
　　 健康雄性Wistar大鼠(300-320g)，予5％水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉，氣管切開，頸動(dòng)、靜脈穿刺，留置導(dǎo)管。監(jiān)測(cè)呼吸頻率、心率、收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓及中心靜脈壓。大鼠狀態(tài)穩(wěn)定半小時(shí)后，隨機(jī)分成5組。A組:正常對(duì)照組，腹正中切口，分離雙側(cè)腎動(dòng)靜脈，不予結(jié)扎雙腎動(dòng)靜脈;給予腹腔注射生理鹽水4ml。B組:急性腎損傷組，腹正中切口，分離雙側(cè)腎動(dòng)靜脈，給予雙腎動(dòng)靜脈夾閉;給予

7、腹腔注射生理鹽水4ml。C組:內(nèi)毒素組，腹正中切口，分離雙側(cè)腎動(dòng)靜脈，不予結(jié)扎雙腎動(dòng)靜脈;給予腹腔注射內(nèi)毒素(5mg/kg)2ml、腹腔注射生理鹽水2ml。D組:急性腎損傷組+SB203580，腹正中切口，分離雙側(cè)腎動(dòng)靜脈，給予雙腎動(dòng)靜脈夾閉;給予腹腔注射生理鹽水2ml、SB203580(p38MAPK的專一抑制劑為吡啶咪唑類衍生物)(2mg/kg)2ml。E組:內(nèi)毒素組+SB203580，腹正中切口，分離雙側(cè)腎動(dòng)靜脈，不予結(jié)扎雙腎動(dòng)靜

8、脈;給予腹腔注射生理鹽水2ml、內(nèi)毒素(5mg/kg)2ml。
　　 2、標(biāo)本收集與檢測(cè)
　　 造模后，各組大鼠分別于實(shí)驗(yàn)開始后的0、2、4、6、8小時(shí)被處死，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死6只大鼠。所有大鼠處死前采集動(dòng)脈血行血?dú)夥治?，處死后留取靜脈血標(biāo)本測(cè)定血肌酐、IL-6與TNF-α。開胸暴露兩肺，先觀察肺臟大體改變，結(jié)扎右肺門，取右上肺，用4％多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木素伊紅(HE)染色檢查肺組織病理變化及免疫熒光(I

9、F)方法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白F、G(actin-F、G);右肺中葉，迅速液氮凍存待測(cè)AQP1、α-ENac、磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)及磷酸化熱休克蛋白27(p-HSP27);取右下肺，用濾紙吸去右肺下葉血，稱濕重后，置烤箱中(80℃，72 h)烤至恒重，稱干重，計(jì)算肺W/D比值。左側(cè)肺行支氣管肺泡灌洗，收集到的支氣管肺泡灌洗液(BALF)凍存待測(cè)IL-6、TNF-α與BALF中蛋白含量。
　　 3、

10、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均以(x)±s表示。組間比較采用t檢驗(yàn)。兩組值的相關(guān)性檢驗(yàn)用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、A組大鼠在實(shí)驗(yàn)后血肌酐濃度沒有明顯變化。B組在實(shí)驗(yàn)后6小時(shí)、8小時(shí)肌酐水平明顯增加，與A組相比有顯著性差異。C組實(shí)驗(yàn)后血肌酐濃度也沒有明顯變化，與A組比較無明顯變化。
　　 2、B組大鼠在實(shí)驗(yàn)后6小

11、時(shí)動(dòng)脈血pH值開始下降，酸中毒逐漸加重，與其它組相比有顯著性差異。各組動(dòng)脈血二氧化碳呈下降趨勢(shì)，但各組間沒有差別，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B組與A組的氧分壓各時(shí)間點(diǎn)間相比無差別，C組氧分壓從6小時(shí)開始逐漸下降，與其它兩組比較有差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3、與A組相比，C組和B組在實(shí)驗(yàn)后2小時(shí)肺泡灌洗液中蛋白水平、肺W/D開始明顯增加，C組與B組相比有顯著性差異。在給予了p38MAPK抑制劑SB203580后的D組及E組肺泡灌洗液中蛋白

12、水平及肺W/D分別比B及C組明顯減少。相對(duì)于D組來說，E組肺泡灌洗液中蛋白水平較高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4、B組與C組實(shí)驗(yàn)后8小時(shí)肺泡上皮腫脹，肺泡壁增寬，肺泡間質(zhì)和肺泡腔水腫明顯，肺泡內(nèi)炎癥細(xì)胞、紅細(xì)胞和蛋白滲出明顯增多，表現(xiàn)出急性肺損傷的典型病理改變，但B組的肺損傷程度較輕。在給予了p38MAPK抑制劑SB203580后的D及E組內(nèi)可見肺泡內(nèi)炎癥細(xì)胞、紅細(xì)胞和蛋白滲出、間質(zhì)與肺泡水腫均較B組及C組減輕。
　　 5、

13、B組與C組均在實(shí)驗(yàn)后2小時(shí)血清及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6的濃度開始增加，與A組相比有顯著差異。同時(shí)與B組相比，C組大鼠血清及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6的濃度明顯增加。
　　 6、B組大鼠在實(shí)驗(yàn)后2小時(shí)肺組織中AQP1、α-ENac表達(dá)開始逐漸減少，與A組相比有明顯的差異性;C組大鼠肺組織中AQP1、α-ENac的表達(dá)減少更加明顯，與A組和B相比均有顯著差異。大鼠的肺AQP1、α-ENac與肺泡灌洗液中TNF-α、I

14、L-6成負(fù)相關(guān)，C組的AQP1、α-ENac與TNF-α、IL-6的相關(guān)性好于B組。
　　 7、運(yùn)用Western blot方法檢測(cè)肺組織中p-p38MAPK及p-HSP27濃度，B組與C組均在實(shí)驗(yàn)后2小時(shí)p-p38MAPK及p-HSP27的肺內(nèi)表達(dá)開始增加，與A組相比有顯著性差異。C組大鼠p-p38MAPK及p-HSP27的表達(dá)比B組明顯增加。在給予了p38MAPK抑制劑SB203580后的D組及E組肺p-HSP27的表達(dá)分別

15、比B及C組明顯減少。
　　 8、B、C兩組實(shí)驗(yàn)后8小時(shí)的F-actin的表達(dá)明顯比A組實(shí)驗(yàn)后0小時(shí)及8小時(shí)的表達(dá)增加，給予p38MAPK抑制劑SB203580的D組、E組F-actin的表達(dá)分別比B組、C兩組減少。
　　 9、B組肺泡灌洗液中細(xì)胞因子TNF-α、IL-6與p-p38MAPK成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.565、0.434。C組肺泡灌洗液中細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的與p-p38MAPK成正相關(guān)，r=0.6

16、33、0.494。C組的相關(guān)性好于B組。
　　 結(jié)論：
　　 1、這表明通過對(duì)大鼠雙側(cè)腎動(dòng)靜脈的夾閉，可以成功的建立急性腎損傷模型。
　　 2、急性腎損傷早期肺泡上皮-內(nèi)皮屏障功能已經(jīng)受到了影響，肺泡內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，肺上皮細(xì)液體清除下降，急性肺損傷已經(jīng)發(fā)生，但與內(nèi)毒素引起的急性肺損傷相比程度較輕。
　　 3、急腎損傷后可能由于體內(nèi)各種有毒代謝產(chǎn)物的蓄積及手術(shù)創(chuàng)傷等激活了全身炎癥反應(yīng)，并且炎癥介質(zhì)通過腎

17、臟的排瀉、滅活而減少，從而使大鼠血液循環(huán)中TNF-α、IL-6含量明顯增加。但與急性腎損傷組相比，內(nèi)毒素引起的TNF-α、IL-6增高更加明顯。
　　 4、急性腎損傷的早期肺表達(dá)AQP1及α-ENac的減少，可能是急性腎損傷早期引起肺損傷的原因之一;并且AQP1及α-ENac表達(dá)下降，細(xì)胞因子起了重要的作用。急性腎損傷后不僅細(xì)胞因子參與了AQP1及α-ENac的調(diào)節(jié)，血漿滲透壓的改變、酸中毒等可能也參與了AQP1及α-ENac的

18、調(diào)節(jié)。
　　 5、通過雙腎動(dòng)靜夾閉誘導(dǎo)的急性腎損傷可以通過激活p38MAPK-HSP27信號(hào)通路，引起急性肺損傷的發(fā)生。如阻斷p38MAPK-HSP27信號(hào)通路可以減輕肺損傷的發(fā)生。
　　 6、在通過腹腔注射內(nèi)毒素引起的急性肺損傷的過程中，p38MAPK-HSP27信號(hào)通路也發(fā)揮了重要的作用。但急性腎損傷激活p38MAPK-HSP27信號(hào)通路的始動(dòng)因素除了TNF-α、IL-6外，急性腎損傷引起的體內(nèi)內(nèi)環(huán)境的改變，如酸中毒