富硒酵母對銅過量導致小鼠肝損傷保護作用的實驗研究.pdf

1、銅作為機體一種重要的必需的微量元素，能維護骨骼、血管和皮膚正常的功能，促進骨骼、血管和皮膚膠原生成，參與機體的各種代謝。由它組成的酶類與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展直接相關(guān)，其中包括糖尿病、冠心病、動脈粥樣硬化、高血脂等。目前研究微量元素多數(shù)重視的是鋅、鐵、硒等，而銅經(jīng)常是被忽略的。因此，了解人體銅的營養(yǎng)狀況，以及進一步了解銅在機體健康和疾病中的作用顯得非常必要。 鑒于目前對于銅缺乏研究較多，但銅過量造成的危害以及如何防治等的實驗報道研

2、究很少。而且急性銅中毒或者銅過量的病例也很常見，如臨床上的Wilson病（肝豆狀核變性）是由于基因突變引起過量的銅沉積在肝內(nèi)，最終導致肝功能受損的一系列的過程。 微量元素硒在人和動物體內(nèi)的吸收、代謝、運轉(zhuǎn)、分布等規(guī)律受肝臟制約，硒是GSH-Px的必需組成部分，GSH-Px能催化還原型谷胱苷肽變成氧化型谷胱苷肽，同時使有毒的過氧化物（ROOH）還原成無害的羥基化合物，并使H2O2分解，因而可以保護細胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的損

3、害和干擾。因此，本文需要探導的是硒能否拮抗過量銅造成機體的損害。 目的: 過量的銅對肝臟具有損傷作用，而微量元素硒作為一種有毒金屬的拮抗劑，對于銅具有拮抗作用。以往有人用亞硒酸鈉進行實驗，但這種無機硒的毒副作用大。本實驗選用富硒酵母作為拮抗劑來代替亞硒酸鈉進行實驗研究，是因為酵母是人類利用最廣的微生物，其蛋白質(zhì)含量高達50%以上，還含有豐富的B族維生素和多種礦物質(zhì)，被稱為優(yōu)質(zhì)營養(yǎng)之源，并且具有高度的富硒能力及將化學硒轉(zhuǎn)化

4、為生物硒的能力，大大消除了亞硒酸鈉作為一種化學硒對生物體所產(chǎn)生的毒副反應和胃腸刺激。以往研究表明，它能夠更高效、更安全地被生物體吸收利用。因此，富硒酵母可以適當?shù)淖鳛橐环N保健品添加到我們的日常食物當中，以此對患有此類疾病人群的肝臟起到一定的保護作用。 基于上述觀點，本實驗通過建立小鼠銅過量的實驗模型和富硒酵母拮抗銅過量的實驗研究，以觀察富硒酵母拮抗過量銅引起的肝損傷的效果及其保護作用的可能機制。 方法: 試驗一：

5、（銅過量的實驗模型）實驗動物為昆明小鼠，采用喂以普通全價顆粒飼料輔以定期定量灌胃不同劑量銅溶液，快速建立銅過量動物模型并觀察動物體內(nèi)銅水平的高低、肝臟的病理損傷及其體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化水平。具體造模方法如下：32只昆明小鼠平均分為4組，第1組為對照組，每天用灌胃生理鹽水2次，第2、3、4組作為實驗組，分別用不同濃度（12.8、25.6和38.4 mg/ml）的硫酸銅每日灌胃2次，16周后，觀察肝組織中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（S

6、OD）以及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性，測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）以及血清和肝組織中銅含量，并做肝臟病理以及電鏡檢查。統(tǒng)計學分析實驗結(jié)果以平均數(shù)±標準差（x±s）表示，應用SPSS11.5軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），多重比較采用LSD法，肝臟中銅和MDA含量數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗方差不齊，以Welch法進行近似方差分析，多重比較采用Tamhane's T2法，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學

7、意義。 試驗二：（硒拮抗過量銅效果實驗）40只昆明小鼠雌雄各半，平均體重18～22 g。所有小鼠隨機分成5組，每組8只，A組：每天用生理鹽水灌胃（0.2 ml/次）兩次作為正常對照組；B、C、D、E組每天均用512 mg/kg bw·d硫酸銅（以銅計）灌胃，共20 w，作為實驗處理組；第16 w時，以灌胃方式分別給予B、C、D組小鼠不同劑量的富硒酵母，即B組：富硒酵母高劑量（60 mg/kg bw·d），C組：富硒酵母中劑量組（

8、40 mg/kg bw·d），D組：富硒酵母低劑量組（20 mg/kgbw·d）；E組小鼠用羧甲基纖維素（為配制富硒酵母的溶劑）灌胃，作為處理對照組。小鼠雌雄分養(yǎng)于塑料不銹鋼籠內(nèi)，室內(nèi)溫度（23±3）℃，自由進食，飲去離子水。第20 w末，所有動物麻醉后處死。 觀察補硒對肝臟丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性以及血清和肝組織中銅含量的影響，并進行肝臟病理組織學檢查和肝細胞凋亡檢

9、測，同時測定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性。實驗結(jié)果以平均數(shù)±標準差（x±s）表示，應用SPSS11.5軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），多重比較采用LSD法，肝臟中銅含量數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗方差不齊，以Welch法進行近似方差分析，多重比較采用Tamhane's T2法，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 試驗一： 第一部分：小鼠銅過量模型的建立。 1.銅過量小

10、鼠的一般狀況： 膚色：與對照組比較，銅過量模型組小鼠在實驗第3周開始出現(xiàn)皮毛粗糙、稀疏，毛色失去光澤，耳、腳爪、尾巴均出現(xiàn)明顯的色澤蒼白，牙齒呈黃褐色，并隨著實驗的時間延長上述癥狀更加明顯。 行為改變：隨著實驗的進行，銅過量模型組小鼠生長緩慢，身體消瘦。表現(xiàn)出倦怠，活動減少，反應遲鈍，怕冷嗜睡蜷縮成團，易受驚嚇，飲食明顯減少。 2.各臟器銅含量及血清銅濃度的比較： 銅過量模型組小鼠的各臟器銅含量和血清銅濃

11、度與對照組比較均有明顯升高（P<0.01），且都隨灌胃時間的延長而升高，但心臟中的銅含量在低劑量組和中劑量組之間比較差異無顯著性，（P>0.05）。各主要臟器中肝臟內(nèi)銅的沉積量最大，心臟最少，沉積情況依次排列如下：肝臟>脾臟>腎臟>肺臟>心臟。 3.血清SOD活性和MDA含量的比較： 銅過量模型組小鼠血清中SOD的活性與對照組比較明顯降低（P<0.01），并隨著灌胃時間的延長有逐漸降低的趨勢。銅過量模型組小鼠血清中MDA

12、含量與對照組比較均明顯升高（P<0.01）。 4.各組小鼠肝臟病理組織學與酶的檢查： 小鼠肝臟病理學檢查表明過多的銅沉積可以損傷細胞，使細胞排列紊亂、邊界不清，發(fā)生水樣變性、壞死等病理改變，且在匯管區(qū)程度較重，正常組小鼠的肝臟肉眼可見光滑細潤，色紅，邊緣銳利，光鏡下HE染色可見細胞排列整齊，細胞形態(tài)規(guī)則，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉輪廓清晰，肝索排列整齊。模型組特別是高劑量組小鼠的肝臟可見色暗紅且增大，質(zhì)地

13、較脆，光鏡下肝細胞排列紊亂，細胞腫脹，空泡樣變性，并出現(xiàn)輕度淤血，細胞點狀壞死，并可見炎癥細胞浸潤，在肝小葉間可見點狀銅顆粒沉積。 與正常對照組相比，實驗組肝組織中MDA含量明顯升高（P<0.05），而SOD和GSH-Px活性明顯下降（P<0.05）；血清ALT、AST活性以及血清、肝臟銅含量明顯升高（P<0.05）；病理組織學檢查可見高劑量銅灌胃組小鼠肝細胞變性壞死以及少量銅顆粒沉積；電鏡提示肝細胞核、線粒體等細胞器異常，并可

14、見銅顆粒。 試驗二： 第二部分：富硒酵母對銅過量導致小鼠肝損傷保護作用的實驗研究。 1.不同濃度富硒酵母對小鼠銅過量導致肝臟損傷ALT、AST活性變化情況： 與正常對照組相比，處理對照組和補硒組（低、中、高劑量組）小鼠血清ALT、AST含量顯著升高（P<0.05），而低、中劑量組小鼠血清ALT、AST含量顯著低于處理對照組（P<0.05）。低、高劑量補硒組小鼠血清Cu含量顯著高于正常對照組（P<0.05）

15、，但顯著低于處理對照組（P<0.05）；而中劑量補硒組小鼠血清Cu含量與正常對照組無顯著差異（P>0.05），但顯著低于處理對照組（P<0.05）。低、中、高劑量補硒組小鼠肝臟Cu含量均顯著高于正常處理組（P<0.05），而低于對照處理組（P<0.05），但中劑量補硒組肝銅含量顯著低于高、低補硒組。 2. 肝細胞凋亡和肝勻漿SOD、MDA、GSH-Px活性。 正常對照組小鼠肝臟可見少量凋亡細胞，而處理對照組有較多凋亡的肝

16、細胞；給予低、中劑量的富硒酵母后肝細胞凋亡有所減少，以中劑量組凋亡率減少最顯著（P<0.05）。處理對照組小鼠肝勻漿SOD和GSH-Px活性顯著低于正常對照組（P<0.05），低、中補硒后活性升高，以中劑量補硒組效果最顯著（P<0.05）（表2）。處理對照組小鼠肝勻漿MDA含量顯著高于正常對照組（P<0.05），低、中補硒后MDA含量降低，以中劑量補硒組效果最顯著（P<0.05）。 3. 肝臟病理組織學檢查。 正常對照組

17、小鼠肝臟肉眼見光滑細潤，色紅，邊緣銳利，光鏡下HE染色可見細胞排列整齊，細胞形態(tài)規(guī)則，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉輪廓清晰，肝索排列整齊，處理對照組和高劑量補硒組小鼠肝臟可見色暗紅且增大，質(zhì)地較脆，光鏡下肝細胞排列紊亂，細胞腫脹，空泡樣變性，并出現(xiàn)輕度淤血，細胞點狀壞死，在空白組肝小葉間還可見點狀銅顆粒沉積，低、中劑量補硒組小鼠肝臟肉眼見接近正常，鏡下細胞腫脹和空泡樣變性有所減輕，銅顆粒少見。 過量硫酸銅能導致小鼠