呼出氣冷凝液中亞硝酸鹽在判定哮喘嚴(yán)重程度的作用.pdf

1、1. 研究背景和目的: 支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是由多種細(xì)胞（如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等）和細(xì)胞組分（cellular elements）參與的氣道慢性炎癥性疾患。這種慢性炎癥導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性的增加，通常出現(xiàn)廣泛可變的可逆性氣流受限，并引起反復(fù)發(fā)作的喘息、氣急、胸悶或咳嗽等癥狀，常在夜間和（或）清晨發(fā)作、加劇，多數(shù)患者可自行緩解或經(jīng)治療緩解。 哮喘是嚴(yán)重的全球健康問題，約有3億人受累，

2、全世界不同國(guó)家不同年齡的人群都被這種慢性氣道紊亂困擾，若控制不良會(huì)嚴(yán)重限制日常活動(dòng)，有時(shí)甚至是致命的。大多數(shù)國(guó)家哮喘的患病率在上升，尤其在兒童。哮喘是沉重的負(fù)擔(dān)，不僅因?yàn)獒t(yī)療花費(fèi)，而且喪失勞動(dòng)力。 因此，對(duì)哮喘的研究具有重要的公共衛(wèi)生及社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。對(duì)哮喘病情觀察的傳統(tǒng)方法主要是基于臨床癥狀和肺功能檢查，這些指標(biāo)并未能從哮喘的本質(zhì)特點(diǎn)慢性氣道炎癥進(jìn)行監(jiān)測(cè)。目前很多研究發(fā)現(xiàn)呼出氣一氧化氮（exhaled nitric oxide，

3、eNO）與氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性具有顯著相關(guān)性，eNO可以用于哮喘的診斷及呼吸道疾病的鑒別診斷。但是eNO的檢測(cè)需患者保持恒定的呼氣流速，且直接監(jiān)測(cè)eNO的測(cè)定儀器價(jià)格昂貴，以上因素限制其在臨床廣泛應(yīng)用。呼出氣冷凝液（Exhaled breatcondensate，EBC）檢測(cè)是近年來發(fā)展起來的一種無創(chuàng)檢測(cè)呼吸道疾病炎癥狀態(tài)的方法，它是評(píng)價(jià)氣道炎癥和氧化應(yīng)激程度的一種無創(chuàng)手段，具有簡(jiǎn)便、易行、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可以適用于任何年齡和狀態(tài)的病

4、人，包括小孩和機(jī)械輔助呼吸的病人。目前，一些學(xué)者認(rèn)為EBC是收集eNO的一種方法，研究EBC的NO反應(yīng)產(chǎn)物可以間接反應(yīng)NO的變化情況。本研究試圖檢測(cè)支氣管哮喘急性發(fā)作期患者EBC中NO2-（NO反應(yīng)產(chǎn)物之一）的含量，比較與正常對(duì)照的差異，進(jìn)一步了解其是否可成為評(píng)估哮喘嚴(yán)重程度的指標(biāo)。 2. 研究對(duì)象和方法: 2.1 對(duì)象2006年02月-2008年07月深圳市第六人民醫(yī)院急診及呼吸科門診或住院患者60例，均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)

5、呼吸病學(xué)會(huì)分會(huì)哮喘學(xué)組2003制定的支氣管哮喘防治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)，按急性發(fā)作期病情嚴(yán)重程度分級(jí)，其中輕度23例，男10例，女13例，年齡25～47歲，平均（40.0±5.0）歲；中度21例，男11例，女10例，年齡20～45歲，平均（37.7±9.6）歲；重度16例，男9例，女7例，年齡19～49歲，平均（37.6±9.1）歲。正常對(duì)照組：選取健康人23名，其中男11名，女12名，年齡18～48歲，平均（40.6±7.8）歲，各組間性別

6、（X2=0.720，P=0.868）和年齡（F=0.766，P=0.517）無顯著差異。 2.2 病例排除標(biāo)準(zhǔn)年齡<16歲或者>50歲；孕產(chǎn)婦、哺乳期婦女；吸煙者，或近3個(gè)月內(nèi)有規(guī)律的被動(dòng)吸煙；近3天食用腌制食品；試驗(yàn)前四周內(nèi)有呼吸系統(tǒng)感染病史；哮喘急性發(fā)作期患者伴有呼吸系統(tǒng)感染：患有哮喘以外的呼吸道慢性疾病史；有高血壓、糖尿病史；試驗(yàn)前72小時(shí)內(nèi)曾使用過糖皮質(zhì)激素（吸入、口服、靜脈途徑）、茶堿、支氣管擴(kuò)張劑、白三烯調(diào)節(jié)劑、色甘

7、酸鈉。 2.3 方法: 2.3.1 肺功能檢測(cè)應(yīng)用德國(guó)耶格公司肺功能儀，在收集EBC之后，檢測(cè)呼出50%肺活量時(shí)流速（MEF50%）及FEV1占預(yù)計(jì)值百分比（FEV1%）以及其他肺功能通氣指標(biāo)。 2.3.2 EBC收集采用美國(guó)Respiratory Research公司EBC收集裝置（Rtube）。該裝置由制冷鋁管、保溫套、收集管、推桿、蓋子組成。其中收集管帶有2個(gè)活瓣，經(jīng)口吸氣時(shí)，氣流從底部活瓣進(jìn)入，經(jīng)口呼氣時(shí)

8、，氣流從另一活瓣呼出，進(jìn)入裝置上部冷凝室，形成了冷凝液。收集EBC前受檢者用蒸餾水漱口3次。 從-10℃冰箱中取出制冷鋁管，組裝成EBC收集器。受檢者取坐位，經(jīng)口、平靜潮式呼吸，收集時(shí)間為15分鐘。采集過程中不斷的吞咽口水，若發(fā)生咳嗽或噯氣立即脫開接口，以防止唾液、胃內(nèi)成分的污染。 2.3.3 NO2-的測(cè)定方法. 通過Griess反應(yīng)，NO2-與顯色劑生成有色物質(zhì)，分光光度法測(cè)定NO2-的吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線法（配制相同基體的含有

9、不同濃度NO2-的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測(cè)其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在同樣操作條件下，測(cè)定試樣溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得濃度。）測(cè)出NO2-濃度。 2.3.4 誘導(dǎo)痰的收集、處理和細(xì)胞學(xué)檢測(cè)所有受試對(duì)象在肺功能檢查及收集EBC之后，吸入沙丁胺醇?xì)忪F劑200 μg后霧化吸入3%的氯化鈉溶液10min，有痰則拭鼻涕、漱口、飲水、咳痰；無痰則用4%和5%氯化鈉溶液繼續(xù)霧化，直到收集到痰標(biāo)本3～5 ml。若操作過程中患者癥狀加重不能耐受時(shí)應(yīng)停

10、止誘導(dǎo)痰操作并給予相應(yīng)處理直至緩解。痰涂片可見較多柱狀上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞且鱗狀上皮細(xì)胞占有核細(xì)胞的比例小于20%的標(biāo)本為合格痰標(biāo)本。使用鈍頭鑷子鑷取標(biāo)本中的痰成分，與4倍體積的0.1%二硫蘇糖醇溶液混勻后37℃孵育15 min后用48 μm紗布過濾，濾出液2000 r/min離心10 min后，用PBS（pH7.4，0.1 mmol/L）重懸細(xì)胞沉淀，2 500 r/min離心，細(xì)胞沉渣涂片。每份標(biāo)本制作3張以上涂片，瑞氏染色，油鏡下計(jì)

11、數(shù)400個(gè)非鱗狀細(xì)胞，計(jì)嗜酸細(xì)胞百分比（Eos%）。鱗狀細(xì)胞>20%為不合格痰標(biāo)本。 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理運(yùn)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示。計(jì)量資料用X2檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用Levene檢驗(yàn)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。兩組樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（方差齊時(shí)）或校正的方差分析（（Welch法），方差不齊時(shí)）檢驗(yàn)，兩兩間比較用LSD-t檢驗(yàn)（方差齊時(shí)）或Tambane's

12、 T2檢驗(yàn)（方差不齊時(shí)）；用Pearson進(jìn)行相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 3.1 哮喘組和對(duì)照組NO2-、 Eos%及MEF50%、FEV1%的比較。 哮喘組患者NO2-（2.33±1.12）μmol/L較正常對(duì)照組（0.59±0.25）μmol/L顯著增高（t=-11.301，P=0.000），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：哮喘組患者誘導(dǎo)痰Eos%（23.43±8.47）%與正常對(duì)照組（1.

13、36±0.37）%相比，有顯著性差異（t=-20.121，P=0.000）。哮喘組患者M(jìn)EF50%為（62.99±15.56）%，低于對(duì)照組（91.17±9.28）%（t=8.128，P=0.000），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。哮喘組患者FEV1%為（68.55±16.85）%，低于對(duì)照組（93.40±8.49）%（t=8.862，P=0.000）， 有顯著性差異。 3.2 不同嚴(yán)重程度急性發(fā)作期哮喘患者EBC中NO2-及誘導(dǎo)痰Eos%和M

14、EF50%、FEV1%比較。 在哮喘急性發(fā)作輕、中、重度組及正常對(duì)照組中EBC中NO2-的值分別為（1.42±0.25）μmol/L、（2.24±0.66）μmol/L、（3.77±0.88）μmol/L、（0.59±0.25）μmol/L，兩兩間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=107.794，P=0.000）；在哮喘急性發(fā)作輕、中、重度組及正常對(duì)照組中誘導(dǎo)痰Eos%分別為（16.36±3.00）%、（22.86±4.74）%、（3

15、4.33±5.95）%、（1.36±0.37）%，兩兩間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=468.143，P=0.000）；在哮喘急性發(fā)作輕、中、重度組及正常對(duì)照組中MEF50%分別為（75.48±11.20）%、（61.99±9.97）%、（46.33±10.00）%、（91.17±9.28）%，兩兩間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=68.712，P=0.000）；在哮喘急性發(fā)作輕、中、重度組及正常對(duì)照組中FEV1%分別為（82.70±6.52

16、）%、（70.67±7.78）%、（45.44±9.52）%、（93.40±8.49）%，兩兩間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=121.638，P=0.000）；且病情越重，NO2-及Eos%值越高，MEF50%和FEV1%則越低。 3.3 急性發(fā)作期哮喘患者EBC中NO2-、誘導(dǎo)痰Eos%與肺功能指標(biāo)相關(guān)性分析。 急性發(fā)作期哮喘患者EBC中NO2-水平和誘導(dǎo)痰中Eos%呈顯著正相關(guān)（r=0.762，P=0.000）；NO2