食物過敏原誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎發(fā)生的分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一組病因尚不十分明確的慢性腸道炎癥性疾病，包括克羅恩?。?Crohn’s disease, CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis, UC）。近年來，隨著其發(fā)病率的不斷增高，IBD成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。研究表明遺傳因素、異常免疫反應(yīng)、感染等因素都與IBD的發(fā)病有關(guān)，也有人提出攝入的食物與IBD的發(fā)生相關(guān)，但其確切發(fā)

2、病機(jī)制尚不清楚。IBD根據(jù)其發(fā)病的免疫特征可分為為Th(T-helper)1型免疫應(yīng)答和Th2型免疫應(yīng)答，目前認(rèn)為CD是Th1相關(guān)的炎癥反應(yīng)性疾病，而UC則是以Th2型免疫應(yīng)答為主的炎癥損傷，主要表現(xiàn)為Th2細(xì)胞及其分泌的相關(guān)細(xì)胞因子增多。食物過敏（food allergy, FA）是指致敏性食物抗原打破機(jī)體免疫耐受而誘發(fā)的腸道異常免疫反應(yīng)，近年來呈逐漸上升的趨勢。它是以Th2型免疫應(yīng)答為主，同時(shí)產(chǎn)生食物過敏原特異性IgE抗體。一些臨床

3、研究發(fā)現(xiàn)食物過敏與IBD的發(fā)生相關(guān)，然而具體機(jī)制還未完全闡明。
　　T細(xì)胞免疫球蛋白與黏蛋白域蛋白(T cell immunoglobulin domain and mucin domain, TIM)4表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell, APC），尤其是成熟的樹突狀細(xì)胞（dendritic cell, DC），近年來發(fā)現(xiàn)它是T細(xì)胞重要的調(diào)節(jié)因子，TIM1是其受體，主要存在于T細(xì)胞表面，TIM1與

4、TIM4之間的相互作用在誘導(dǎo)Th2免疫應(yīng)答中起著十分重要的作用。研究表明，TIM4與一些過敏性疾病的發(fā)生相關(guān)，一些微生物的產(chǎn)物如霍亂毒素（ cholera toxin, CT)可以誘導(dǎo)DC表達(dá)TIM4，然而其具體機(jī)制尚不明確，是否TIM4誘導(dǎo)的Th2免疫應(yīng)答反應(yīng)在IBD的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，仍不十分清楚。
　　組蛋白的乙?；揎椗c許多疾病致病基因的激活和轉(zhuǎn)錄有關(guān)，分別由組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransf

5、erases, HATs）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases, HDAC）催化完成。其中腺病毒E1A結(jié)合蛋白p300是HATs的主要成員，可調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，與過敏性疾病相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)p300可誘導(dǎo)Th2極化，而信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子（Signal Transducer and Activator of Transcription， STAT）6是誘導(dǎo)Th2細(xì)胞分化的主要調(diào)控因子，在白細(xì)胞介素（interleu

6、kin, IL）-4存在情況下，STAT6可以募集p300與核受體輔激活蛋白-1（nuclear receptor coactivator, NCOA-1）來激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。是否p300通過激活STAT6調(diào)節(jié)TIM4的基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而誘導(dǎo)Th2極化促進(jìn)食物過敏及相關(guān)結(jié)腸炎發(fā)生仍需進(jìn)一步闡明。
　　免疫球蛋白IgE在I型超敏反應(yīng)中起著十分重要的作用，例如過敏性哮喘、食物過敏及過敏性皮炎等。食物過敏小鼠體內(nèi)可發(fā)現(xiàn)血清總IgE及血清與腸黏膜

7、食物抗原特異性IgE的增高，一些臨床證據(jù)也發(fā)現(xiàn)某些IBD病人血清及腸黏膜IgE是增高的，然而具體誘導(dǎo)IgE增高的機(jī)制仍不明了。研究發(fā)現(xiàn)人類B細(xì)胞淋巴瘤蛋白-6(B cell lymphoma6 protein, Bcl-6)作為一種序列特異性轉(zhuǎn)錄抑制因子可以控制B細(xì)胞生發(fā)中心和抑制IgE轉(zhuǎn)化，Bcl6可以利用HDAC7通過啟動(dòng)子位點(diǎn)的染色質(zhì)重塑來行使轉(zhuǎn)錄抑制作用。是否HDAC7通過調(diào)節(jié)Bcl6基因從而誘導(dǎo)gE的表達(dá)，促進(jìn)食物過敏及相關(guān)結(jié)

8、腸炎的發(fā)生，有待進(jìn)一步研究。
　　綜上所述，食物過敏與IBD發(fā)生的關(guān)系仍需進(jìn)一步闡明。Th2型IBD的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，TIM4與IgE在食物過敏及其相關(guān)的結(jié)腸炎中發(fā)揮著重要作用，誘導(dǎo)TIM4與IgE表達(dá)的機(jī)分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本研究中，我們將首先應(yīng)用霍亂毒素（cholera toxin, CT）與卵清蛋白（ovalbumin, OVA）建立食物過敏原相關(guān)的結(jié)腸炎模型，初步探討TIM4在其中發(fā)揮的作用，進(jìn)一步評(píng)價(jià)模型小鼠腸

9、道中極化的Th2型炎癥反應(yīng)并證實(shí)食物過敏可能是IBD發(fā)生的一個(gè)因素。然后以食物過敏原誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型為研究基礎(chǔ)，應(yīng)用染色質(zhì)免疫沉淀法（ Chromatin immunoprecipitation, ChIP）及RNAi技術(shù)來研究p300在TIM4及STAT6染色質(zhì)位點(diǎn)重塑中的作用，并采用BALB/c CD45.1與BALB/c CD45.2小鼠，利用骨髓來源樹突狀細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移的方法，進(jìn)一步研究STAT6在CT誘導(dǎo)DC表達(dá)TIM4中的

10、作用。同時(shí)在體外采用細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了B細(xì)胞內(nèi)HDAC7通過抑制Bcl-6基因，進(jìn)而促進(jìn)B細(xì)胞表達(dá)IgE，誘導(dǎo)食物過敏原相關(guān)結(jié)腸炎發(fā)生的分子機(jī)制。
　　研究目的：
　　1.應(yīng)用CT與OVA建立食物過敏原相關(guān)的結(jié)腸炎模型，初步探討TIM4在其中發(fā)揮的作用，并進(jìn)一步證實(shí)食物過敏是IBD發(fā)生的一個(gè)因素。
　　2.應(yīng)用ChIP及RNAi研究p300與STAT6在TIM4啟動(dòng)子位點(diǎn)染色質(zhì)重塑中的作用，進(jìn)一步闡明p300可調(diào)節(jié)

11、TIM4基因轉(zhuǎn)錄。
　　3.利用骨髓來源樹突狀細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移的方法，研究STAT6在CT誘導(dǎo)DC表達(dá)TIM4中的作用。
　　4.證實(shí)B細(xì)胞內(nèi)HDAC7通過抑制Bcl-6基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)B細(xì)胞表達(dá)IgE，誘導(dǎo)食物過敏相關(guān)結(jié)腸炎發(fā)生的分子機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.食物過敏原誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型的建立
　　雄性BALB/c小鼠(6-8周)，每組12只，將OVA(1mg/鼠)和CT(5μg/鼠)溶于0.1ml生

12、理鹽水中，在第0、3天皮下注射致敏，于第5、7、9、11、13、15天給予OVA(1mg/鼠)和（或）CT（20μg/鼠）溶于0.1ml生理鹽水中灌腸進(jìn)行激發(fā)，同時(shí)給予生理鹽水灌腸作為對(duì)照，于第17天同時(shí)處死對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組小鼠，取結(jié)腸組織進(jìn)行下一步分析。
　　2.結(jié)腸組織病理學(xué)檢查
　　取小鼠結(jié)腸組織，制備石蠟切片，蘇木精一伊紅(HE)染色，觀察腸黏膜損傷情況，進(jìn)行結(jié)腸組織學(xué)損傷指數(shù)評(píng)分評(píng)估結(jié)腸黏膜組織損傷情況。組織學(xué)損傷程

13、度根據(jù)病變深度與隱窩破壞程度評(píng)分。
　　3.髓過氧化物酶（MPO）檢測
　　取病變處結(jié)腸10mg，按體積比1:4加入0.1％乙基苯基聚乙二醇，超聲勻漿結(jié)腸組織，4℃離心5min，取上清。按照MPO試劑盒說明書進(jìn)行操作，用化學(xué)比色法測定結(jié)腸組織MPO的活性。在460nm處觀察記錄吸光度的變化（OD值）。MPO活力計(jì)算公式為：MPO活力=(實(shí)驗(yàn)OD值-對(duì)照OD值)/0.1131。
　　4. CD4+T細(xì)胞分離及檢測

14、　　無菌條件下取小鼠結(jié)腸組織，將結(jié)腸組織剪成lcm大小，加入預(yù)消化液預(yù)消化30min，重復(fù)兩次以上。100μm細(xì)胞篩過濾后將剩余腸組織切成lmm左右的碎片，PBS清洗一次離心后，加入消化液消化30min；漩渦混勻器劇烈晃動(dòng)20s，40μm濾網(wǎng)過濾結(jié)腸組織，然后用40/80Percoll分離得到小鼠腸道黏膜固有層單個(gè)核細(xì)胞（LPMC），接著再用免疫磁珠法（MACS）進(jìn)一步分選。將免疫磁珠法分選出的CD4+T細(xì)胞與DC細(xì)胞共培養(yǎng)，并加入不同

15、種類的抗原刺激72小時(shí)后收集并計(jì)數(shù)細(xì)胞，將熒光染料羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰（CFSE）加入已經(jīng)計(jì)數(shù)好的1×106細(xì)胞中使終濃度為10μM，避光染色5分鐘后用預(yù)冷的PBS洗滌1次，再用細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌2次后，1500rpm離心5分鐘后棄上清，F(xiàn)CM檢測。
　　5. Ussing chamber
　　將腸黏膜組織安裝到Ussing chamber儀器上，記錄儀器運(yùn)行30分鐘后的短路電流，根據(jù)歐姆定律算出電阻值，進(jìn)一步計(jì)算出電導(dǎo)值。

16、然后加入不同濃度的CT進(jìn)行刺激，觀察與記錄短路電流與電導(dǎo)的變化，另外在結(jié)腸黏膜側(cè)加入FITC標(biāo)記的OVA，在不同時(shí)間段用免疫熒光儀檢測漿膜側(cè)OVA的熒光量進(jìn)而計(jì)算出OVA的滲出量。
　　6.骨髓來源樹突狀細(xì)胞(BMDC)的分離及培養(yǎng)
　　頸椎脫位法處死小鼠后，無菌條件下分離出小鼠的脛骨和股骨，剪掉其遠(yuǎn)端，用滅菌注射器抽取PBS，插入骨髓腔反復(fù)沖洗直至髓腔變白，收集骨髓懸液，用200目尼龍網(wǎng)濾去小碎片和肌肉組織，離心棄上清后加

17、入1×氯化銨紅細(xì)胞裂解液室溫孵育3-5 min后離心棄上清得到骨髓細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度為0.5-1×106/ml，均勻鋪至24孔培養(yǎng)板內(nèi)，同時(shí)加入重組小鼠 GM-CSF（25 ng/ml）和IL-4（10 ng/ml），37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)，然后吸取懸浮細(xì)胞及培養(yǎng)基，貼壁的為BMDC，加入新鮮培養(yǎng)基及細(xì)胞因子繼續(xù)培養(yǎng)，隔日3/4換液并補(bǔ)足相應(yīng)細(xì)胞因子。培養(yǎng)后的BMDC經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀檢測純度。
　

18、　7. ELISA檢測
　　OVA特異性IgE、腸黏膜總IgE、IL-4、IL-17、TNF-α與IFN-γ細(xì)胞因子的檢測完全按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行，終止反應(yīng)后，15分鐘內(nèi)在酶標(biāo)儀450 nm處讀出吸光度值，減去空白值即為所得吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品中蛋白表達(dá)濃度。
　　8.流式細(xì)胞術(shù)
　　收集培養(yǎng)細(xì)胞并計(jì)數(shù)，每1×106個(gè)細(xì)胞內(nèi)加入流式緩沖液Ⅱ（500mlPBS，0.5g BSA，0.25gNaN3）1

19、ml離心（4℃，800g，8分鐘）洗滌3次；加入熒光標(biāo)記的表面分子抗體，4℃避光靜置30分鐘；然后加入流式緩沖液II離心（4℃，800g，8分鐘）洗滌2次后，棄緩沖洗液，再加入300μL流式緩沖液II重懸細(xì)胞，振蕩混勻，將細(xì)胞懸液用40μm濾網(wǎng)過濾后流式細(xì)胞儀進(jìn)行下一步分析。
　　9.實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）
　　收集培養(yǎng)細(xì)胞并計(jì)數(shù)，1500rpm離心后，1×PBS清洗兩次，離心得到細(xì)胞沉淀，用Trizol法提取

20、細(xì)胞總RNA，所提取的總RNA用紫外分光光度計(jì)計(jì)算濃度，瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。將25ng cDNA加入10μL iQTMSYBRGreen Supermix中，上下游引物各300nM，進(jìn)行PCR擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，陰性對(duì)照采用未轉(zhuǎn)錄RNA作為模版或不加入模版作為對(duì)照。β-actin作為內(nèi)參，最后結(jié)果采用2—△△Ct計(jì)算。
　　10. Western Blotting
　　

21、收集組織或細(xì)胞，加入裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑提取總蛋白，制膠，上樣，用SDS-PGAE法分離條帶，將分離膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上，5％的BSA室溫封閉1小時(shí)；洗膜后，加入一抗4℃搖床過夜，再次清洗后加入二抗室溫?fù)u床孵育1小時(shí)，洗膜后，曝光。
　　11. TIM4啟動(dòng)子報(bào)告基因電轉(zhuǎn)染和熒光素酶檢測
　　TIM4啟動(dòng)子報(bào)告基因由Promega公司構(gòu)建，按照說明書用Gene Pulser II儀將基因電轉(zhuǎn)移入DC內(nèi)，同時(shí)加入CT刺

22、激繼續(xù)培養(yǎng)48h后用Dual熒光報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。
　　12.染色質(zhì)免疫沉淀法（ChIP）
　　收集細(xì)胞，加入1%甲醛交聯(lián)15分鐘，離心后，向細(xì)胞沉淀中加入室溫SDS裂解液和蛋白酶抑制劑裂解細(xì)胞。然后在冰上超聲樣品，超聲之后，離心裂解的產(chǎn)物收集上清液。加入上清液、ChIP稀釋液與ProteinG Agarose，4℃旋轉(zhuǎn)混勻60min。靜置2分鐘后，4℃，5000g離心1min。取上清液10μL作為input

23、，將其余上清液轉(zhuǎn)移置新的EP管，分別加入IP抗體，并設(shè)立陰性對(duì)照、陽性對(duì)照與實(shí)驗(yàn)組，4℃，50-100 RPM旋轉(zhuǎn)混勻過夜。孵育結(jié)束后，再加入60μL ProteinG Agarose4℃，50-100 RPM旋轉(zhuǎn)孵育60min。靜置10min后，4℃，5000g離心1min。去上清，留下沉淀復(fù)合物。清洗沉淀復(fù)合物，每次5分鐘。將沉淀復(fù)合物與input中分別加入40μL包含1μL蛋白激酶K的DNA釋放緩沖液，輕輕混勻，65℃水浴鍋處理1

24、5min。利用Promega回收試劑盒回收DNA片段用于PCR擴(kuò)增。
　　13. RNA干擾（RNAi）
　　包含小鼠p300，STAT6、HDAC7和Bcl-6的shRNA和對(duì)照shRNA慢病毒載體由Santa Cruz公司設(shè)計(jì)和構(gòu)建，并按照慢病毒載體操作說明轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用Lenti-X GoStix鑒定病毒產(chǎn)物；然后用病毒產(chǎn)物轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞，經(jīng)Western Blotting檢測轉(zhuǎn)染效率?；蛞种菩试谵D(zhuǎn)染后48小時(shí)達(dá)到90％

25、，而對(duì)照組shRNA無基因抑制作用。
　　14.分離CD45.2小鼠的BMDCs進(jìn)行過繼轉(zhuǎn)移
　　實(shí)驗(yàn)小鼠分組，每組6只。野生型CD45.2+DCs組（提取野生型BALB/cCD45.2小鼠的BMDCs，以1×106細(xì)胞/鼠尾靜脈注射入BALB/cCD45.1小鼠體內(nèi)）；CD45.2+STAT6?DCs組（對(duì)BALB/cCD45.2小鼠的BMDCs進(jìn)行STAT6基因抑制后，以1×106細(xì)胞/鼠尾靜脈注射入BALB/cCD45

26、.1小鼠體內(nèi)）；CD45.2+對(duì)照shRNA DCs組（對(duì)BALB/cCD45.2小鼠的BMDCs進(jìn)行空載體轉(zhuǎn)染后，以1×106細(xì)胞/鼠尾靜脈注射入BALB/cCD45.1小鼠體內(nèi)），分離LPMC進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。
　　15.小鼠脾臟B細(xì)胞分離與檢測
　　無菌條件下取小鼠脾臟，常規(guī)進(jìn)行脾臟淋巴細(xì)胞分離，然后按照小鼠脾臟B細(xì)胞分離試劑盒說明書用MACS法進(jìn)一步分離小鼠脾臟B細(xì)胞，計(jì)數(shù)B細(xì)胞，并標(biāo)記FITC-CD19，流式檢驗(yàn)

27、分選純度(≥95％)。
　　16.統(tǒng)計(jì)分析
　　所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次重復(fù)，兩組樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組樣本均數(shù)比較采用方差分析(ANOVA)， P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示具有顯著差異。
　　結(jié)果：
　　1.食物過敏原誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型以Th2免疫應(yīng)答為主
　　用食物過敏原OVA及免疫佐劑CT誘導(dǎo)出了食物過敏相關(guān)的結(jié)腸炎模型。小鼠的體重于灌腸

28、之日起急劇下降，灌腸3次后體重下降最多，之后趨于平穩(wěn)。HE染色發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠的結(jié)腸結(jié)構(gòu)完整，而實(shí)驗(yàn)組小鼠的結(jié)腸組織出現(xiàn)黏膜水腫，隱窩變形，腸壁增厚及大量炎癥細(xì)胞浸潤的表現(xiàn)。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組組織學(xué)評(píng)分明顯增高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。我們用MPO檢測試劑盒與ELISA試劑盒分別對(duì)兩組小鼠的結(jié)腸組織提取蛋白進(jìn)行MPO活性及IL-4、TNF-α、IFN-γ、IL-17四種炎癥因子進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，OVA/CT組小鼠M

29、PO活性明顯增高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。腸黏膜分泌的細(xì)胞因子IFN-γ及IL-17在OVA/CT組與對(duì)照組無明顯差異。而IL-4在OVA/CT組較對(duì)照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠sIgE的表達(dá)明顯升高。將CD4+T細(xì)胞用CFSE標(biāo)記后，加入不同抗原刺激后與DC共培養(yǎng)3天，用流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)OVA刺激組小鼠腸黏膜CD4+T細(xì)胞與對(duì)照組BSA相比明顯增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

30、（P<0.01）。說明食物過敏原誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠腸道中出現(xiàn)OVA特異性CD4+T細(xì)胞的明顯增殖。結(jié)合腸黏膜組織表達(dá)IL-4明顯增高，表明OVA/CT誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥反應(yīng)是以Th2免疫應(yīng)答為主。
　　2. CT通過損傷上皮屏障功能促進(jìn)食物過敏原誘導(dǎo)腸道免疫應(yīng)答
　　將分離的結(jié)腸組織置于Ussing chamber儀器上，發(fā)現(xiàn)與結(jié)腸炎組相比，對(duì)照組結(jié)腸組織隨著CT濃度的增高，短路電流Isc及電導(dǎo)Conductance逐漸增高，且呈

31、劑量依賴性增長，當(dāng)CT濃度達(dá)到100μg/ml時(shí)，與結(jié)腸炎組腸黏膜屏障的短路電流及電導(dǎo)變化一致；隨著時(shí)間的推移及CT濃度的增高，OVA穿過腸上皮的流量遞增，當(dāng)CT濃度達(dá)到100μg/ml時(shí)，與結(jié)腸炎組通過OVA的流量一致，說明OVA的流量成時(shí)間和劑量依賴關(guān)系。表明給予CT刺激后可以損傷結(jié)腸上皮屏障功能，促進(jìn)食物抗原的吸收。
　　3.食物過敏相關(guān)的結(jié)腸炎小鼠腸道表達(dá)TIM4的DC細(xì)胞增多了
　　流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)正常對(duì)

32、照組相比，實(shí)驗(yàn)小鼠結(jié)腸黏膜組織表達(dá)TIM4的DC細(xì)胞數(shù)明顯升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。為了進(jìn)一步評(píng)估是否細(xì)菌產(chǎn)物CT在其中起了十分重要的作用，我們將BALB/c小鼠的BMDC分離出來，在體外用不同濃度的CT進(jìn)行刺激，并用Real time-qPCR及Western Blotting進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)隨著CT濃度的增高，DC表達(dá)的TIM4在mRNA與蛋白水平均呈現(xiàn)增高趨勢,且與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)意義（P<0.01）。

33、結(jié)果表明CT可促進(jìn)腸道DC表達(dá)TIM4。
　　4.食物過敏原誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠腸道DC中p300與TIM4的表達(dá)均增高
　　我們評(píng)估了食物過敏原誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠腸道DCs中p300與TIM4的表達(dá)水平。用RT-qPCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)與生理鹽水對(duì)照組p300和TIM4在mRNA水平的表達(dá)相比，從OVA+CT組與單純CT組灌腸小鼠結(jié)腸黏膜組織分離出的DCs中p300與TIM4的表達(dá)明顯增高，Western Blotting在蛋白水平

34、檢測呈現(xiàn)與mRNA水平一致性。結(jié)果表明在腸道過敏條件下，腸道DCs可高表達(dá)p300與TIM4。而且，我們發(fā)現(xiàn)單純CT灌腸組小鼠的腸道DCs表達(dá)的TIM4與p300的水平與OVA+CT組一致，結(jié)果提示CT在腸道DC表達(dá)p300與TIM4中起重要作用。
　　5. p300介導(dǎo)CT誘導(dǎo)DC表達(dá)TIM4
　　野生型BMDC加入CT刺激48h后，TIM4在mRNA水平的表達(dá)較生理鹽水組明顯升高（P<0.01）。同時(shí)，我們用Wester

35、n Blotting檢測了DCs在蛋白水平對(duì)TIM4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)加入CT刺激的野生型BMDC及轉(zhuǎn)入空載體的BMDC與生理鹽水組相比，TIM4的表達(dá)是明顯升高的，表明在體外CT可誘導(dǎo)DCs表達(dá)TIM4。而加入p300的抑制劑及應(yīng)用p300基因抑制的DCs，同樣加入CT刺激，DC對(duì)TIM4的表達(dá)卻沒有變化。這說明了p300可能與CT誘導(dǎo)DCs表達(dá)TIM4相關(guān)。接下來我們將攜帶TIM4啟動(dòng)子序列的熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)染DCs，然后用CT刺激48

36、h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入TIM4啟動(dòng)子序列DCs中檢測到了高的熒光素酶活性，而加入p300抑制劑后熒光素酶活性卻沒有升高。我們進(jìn)一步用Western Blotting檢測了DCs中TIM4蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TIM4在蛋白水平的表達(dá)與熒光素酶活性呈現(xiàn)一致性。結(jié)果證實(shí)了p300介導(dǎo)CT誘導(dǎo)TIM4的表達(dá)。
　　6. p300在CT介導(dǎo)的TIM4啟動(dòng)子位點(diǎn)染色質(zhì)重塑中起作用
　　用ChIP分析p300在TIM4啟動(dòng)子位點(diǎn)染色質(zhì)重塑中的作用，

37、發(fā)現(xiàn)與生理鹽水組相比，食物過敏原誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠組（OVA+CT）及單純CT灌腸組小鼠腸道DCs中TIM4啟動(dòng)位點(diǎn)的p300、H3K4ac、RNA聚合酶II(PolⅡ)及 pSTAT6水平均增高了，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。為了進(jìn)一步在體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證這一結(jié)果，我們用CT分別刺激野生型DCs與p300基因抑制的DCs48h，ChIP分析發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水組相比，CT刺激后野生型的BMDC細(xì)胞內(nèi)的pp300、H3K4ac、Pol I

38、I及pSTAT6水平均增高了，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。且p300基因抑制后的DCs（p300-d）及轉(zhuǎn)入對(duì)照shRNA的DCs同時(shí)用CT刺激后，p300基因抑制后的DCs（p300-d）組TIM4啟動(dòng)子位點(diǎn)pp300、H3K4ac及RNA Pol II表達(dá)水平較生理鹽水刺激組無明顯變化，說明p300基因抑制后，TIM4啟動(dòng)子位點(diǎn)染色質(zhì)的重塑也終止了。
　　7. p300在DCs表達(dá)STAT6中起重要作用
　　為了

39、檢測p300在活化STAT6中的作用，我們在培養(yǎng)基中加入了p300的抑制劑garcinol,結(jié)果發(fā)現(xiàn)p300與STAT6的mRNA水平被終止了。而在培養(yǎng)基中加入STAT6的抑制劑，p300的mRNA仍是增高的，而STAT6的mRNA水平被終止了，可見在DCs中p300影響STAT6的表達(dá)。同時(shí)我們用ChIP檢測DCs中在STAT6啟動(dòng)子位點(diǎn)pp300, H3K4ac, PolⅡ和核受體輔激活蛋白1(NCOA1)的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)隨著CT濃

40、度的增高它們的表達(dá)也增高了，與生理鹽水組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。加入p300抑制劑后，四者表達(dá)均降低，而加入STAT6抑制劑后，僅出現(xiàn)NCOA1的降低。為了進(jìn)一步證實(shí)是否在DCs中NCOA1是STAT6的轉(zhuǎn)錄協(xié)同刺激因子，我們抑制了DCs中的NCOA1基因,然后用CT刺激NCOA1缺失的DCs，同時(shí)刺激轉(zhuǎn)入空載體的DCs作為對(duì)照，我們發(fā)現(xiàn)用CT刺激后，DCs中在STAT6啟動(dòng)子位點(diǎn)p300,pp300, H3K4ac和

41、PolⅡ的表達(dá)仍是升高的，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而STAT6卻沒有表達(dá)，進(jìn)而證實(shí)了NCOA1是DCs中STAT6的轉(zhuǎn)錄協(xié)同刺激因子。
　　8. STAT6介導(dǎo)CT誘導(dǎo)TIM4的表達(dá)
　　從BALB/c CD45.2小鼠中提取BMDCs，用RNAi抑制CD45.2+DCs中STAT6的基因,然后將它們過繼轉(zhuǎn)移給BALB/cCD45.1小鼠。給予BALB/cCD45.1小鼠10μg/mlCT連續(xù)灌腸4天，于第5天

42、處死小鼠，分離腸道LPMC進(jìn)行流式分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TIM4+CD45.2+STAT6?DCs的數(shù)量很少，僅有0.49%，而32.7%的TIM4+DCs在CD45.2+STAT6+DCs被檢測到了。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這個(gè)結(jié)果，我們用MACS從CD45.1小鼠體內(nèi)分離出CD45.2+DCs，然后分別用RT-qPCR和Western Blotting檢測TIM4的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與STAT6?CD45.2+DCs中TIM4的表達(dá)相比， STAT6+C

43、D45.2+DCs中，TIM4的表達(dá)明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明STAT6介導(dǎo)DCs中TIM4的表達(dá)。
　　9. CT通過增加B細(xì)胞內(nèi)HDAC7抑制Bcl6表達(dá)
　　我們在培養(yǎng)基中用CT刺激IL-6激化的B細(xì)胞，結(jié)果表明用CT刺激后，Bcl6的水平在mRNA和蛋白水平均降低了，且呈劑量依賴的關(guān)系，與培養(yǎng)基對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果表明CT可以抑制B細(xì)胞對(duì)Bcl-6的表達(dá)。RT-

44、qPCR結(jié)果表明用CT刺激B細(xì)胞后，HDAC的活性增高了，其中以HDAC7的活性增高最為顯著。我們用不同濃度的CT刺激IL-6預(yù)先處理的B細(xì)胞48h，提取細(xì)胞總蛋白行Western Blotting分析。結(jié)果表明CT增加了B細(xì)胞內(nèi)HDAC7的表達(dá)，而且HDAC7的表達(dá)與CT呈劑量依賴關(guān)系。結(jié)果暗示了HDAC7的增高可能與B細(xì)胞內(nèi)CT調(diào)節(jié)Bcl6相關(guān)。
　　10. HDAC7在B細(xì)胞內(nèi)Bcl6啟動(dòng)子位點(diǎn)染色質(zhì)重塑中起作用
　　

45、我們進(jìn)一步觀察了B細(xì)胞內(nèi)Bcl6啟動(dòng)子位點(diǎn)染色質(zhì)的改變。在體外用CT刺激B細(xì)胞6h后，ChIP分析發(fā)現(xiàn)Bcl6啟動(dòng)子位點(diǎn)pHDAC7、組蛋白3的第9位氨基酸甲基化（H3K9me）和H3K27me的表達(dá)水平均增高，而Pol II和STAT3(Bcl6的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子)的表達(dá)卻被抑制了?？紤]到HDAC7可能是CT誘導(dǎo)Bcl6啟動(dòng)子位點(diǎn)改變的關(guān)鍵因素，我們將B細(xì)胞內(nèi)的HDAC7抑制，用CT刺激轉(zhuǎn)入HDAC7 shRNA的B細(xì)胞6h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CT

46、誘導(dǎo)的Bcl-6啟動(dòng)子位點(diǎn)染色質(zhì)重塑終止了。表明CT可以增加B細(xì)胞內(nèi)HDAC7的表達(dá)，HDAC7的表達(dá)又可以在Bcl6啟動(dòng)子位點(diǎn)增加H3K9me和H3K27me的表達(dá)，抑制 Pol II和STAT3。我們用IL-6與CT共同刺激B細(xì)胞48h后，將細(xì)胞總RNA與蛋白提取出來，分別進(jìn)行 RT-qPCR與Western Blotting分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入CT后無論從mRNA水平還是蛋白水平B細(xì)胞內(nèi)IL-6誘導(dǎo)的Bcl-6的表達(dá)均被抑制了。

47、r>　　11. CT通過抑制B細(xì)胞內(nèi)的Bcl6基因誘導(dǎo)IgE的表達(dá)
　　我們用CT刺激抑制和沒有抑制Bcl6基因的B細(xì)胞4天，用RT-qPCR及Western Blotting從mRNA及蛋白水平觀察IgE的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)在Th2極化條件下（加入IL-4共培養(yǎng)）下，CT刺激B細(xì)胞表達(dá)高水平的IgE，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而單獨(dú)給予CT或IL-4并沒有出現(xiàn)這種情況。為了進(jìn)一步驗(yàn)證抑制Bcl-6基因可以促進(jìn)IgE

48、的表達(dá)，我們將Bcl-6基因抑制，然后用CT/IL-4分別刺激轉(zhuǎn)入controlshRNA和Bcl6 shRNA的B細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)刺激轉(zhuǎn)入control shRNA的B細(xì)胞無論從蛋白水平還是mRNA水平IgE的表達(dá)均明顯升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；而轉(zhuǎn)入Bcl6 shRNA的B細(xì)胞給予刺激后， IgE的表達(dá)卻沒有變化。表明Bcl-6在IgE的表達(dá)中起著十分重要的作用。
　　結(jié)論：
　　1.首次通過給予小鼠細(xì)菌產(chǎn)物

49、CT與食物過敏原OVA灌腸建立了食物過敏原誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型，進(jìn)一步證實(shí)食物過敏相關(guān)的免疫應(yīng)答與結(jié)腸炎發(fā)生的關(guān)系。
　　2.發(fā)現(xiàn)細(xì)菌產(chǎn)物CT誘導(dǎo)腸道DCs表達(dá)的TIM4在食物過敏原誘導(dǎo)的腸道炎癥中起到重要作用。
　　3.從分子機(jī)制上證實(shí)了組蛋白乙?；竝300在TIM4啟動(dòng)子位點(diǎn)染色質(zhì)重塑中的作用，在CT刺激下通過調(diào)節(jié)腸道DCs表達(dá)TIM4促進(jìn)Th2型炎癥反應(yīng)的發(fā)生。
　　4.進(jìn)一步闡明了給予CT刺激后，p300表達(dá)的增