生物成像用新型發(fā)光探針的研究.pdf

1、活細胞內單分子行為研究和活體動物成像已經(jīng)成為熒光生物成像的前沿領域。然而在單分子和活體動物這兩種極端的情況下,生物樣品中大量存在的內源性熒光物質產(chǎn)生的自發(fā)熒光會對標記分子的熒光信號產(chǎn)生非常嚴重的干擾。為了解決生物成像中自發(fā)熒光干擾的問題,我們必須開發(fā)一些能完全消除自發(fā)熒光干擾的“新型發(fā)光探針”。本論文針對這一目標開展研究,主要包括四個部分。
　　 1.紅色熒光化學計量器用于活細胞內Cu2+的熒光成像
　　 從發(fā)光波長方面

2、考慮,利用生物組織對紅光和近紅外光的吸收非常弱的特點,并考慮到明確生理過程中銅的濃度和亞細胞分布的變化情況對于研究銅的復雜生理功能和致病機理具有重要的意義。
　　 我們設計合成了一個含有高電負性S原子的羅丹明B衍生物,實驗表明這個化合物是一個Cu2+化學計量器,對Cu2+的響應表現(xiàn)為紅光區(qū)的發(fā)射增強。利用一個Cu2+促進的羅丹明開環(huán)、氧化還原和水解反應的識別機理,加入Cu2+引起的熒光強度的增加和吸收強度的增加相當,說明以此化學

3、計量器為探針可以有效地避免Cu2+順磁性造成的熒光淬滅。更重要的是,這個探針能快速(響應時間≤1min)、高靈敏(檢出限≤10ppb)、高選擇地識別Cu2+。單光子、雙光子熒光成像及臺盼藍細胞活性實驗證實該探針可以用于檢測活細胞中的Cu2+,顯示Cu2+的亞細胞分布。
　　 2.磷光重金屬配合物用于活細胞磷光成像
　　 利用磷光重金屬配合物為探針,結合時間分辨成像技術,可以區(qū)分來自標記物的壽命較長的發(fā)光(～μs)和壽命較

4、短的自發(fā)熒光(～ns),有望完全消除自發(fā)熒光的干擾。銥配合物是一類性質優(yōu)異的磷光重金屬配合物,但其在生物成像中的應用尚未見文獻報道。
　　 首先,我們合成了兩個具有明亮的綠光和紅光發(fā)射的陽離子型銥配合物,并且證明了它們是特異性染色活細胞胞漿的磷光染料。這兩個銥配合物在緩沖溶液中發(fā)光效率較高,很容易穿過細胞膜進入細胞,專一性地染色細胞的胞漿區(qū)域,且細胞毒性低,光穩(wěn)定性相較于有機染料DAPI有所提高,是一類性能優(yōu)良的小分子磷光探針。

5、其次,我們將一個對組氨酸有發(fā)光響應的銥配合物用于細胞成像,發(fā)現(xiàn)它能快速且特異性地染色活細胞和固定細胞的細胞核,并僅在細胞核區(qū)域表現(xiàn)出明亮的發(fā)光。
　　 3.稀土上轉換發(fā)光納米材料用于激光掃描上轉換發(fā)光顯微成像(LSUCLM)
　　 稀土上轉換發(fā)光納米材料(UCNPs)在980nm連續(xù)光激發(fā)下具有獨特的上轉換發(fā)光過程,是一類非常有潛力的生物標記材料。
　　 我們發(fā)現(xiàn)UCNPs上轉換發(fā)光的成像形式非常特殊,非焦面的上

6、轉換發(fā)光信號會使焦面細節(jié)完全模糊,導致圖像分辨率很差。通過引入反式的激發(fā)二色分鏡和共聚焦針孔技術,我們成功地消除了非焦面的上轉換發(fā)光的干擾,并且發(fā)展了一種新的三維成像方法,即激光掃描上轉換發(fā)光顯微成像(LSUCLM)技術。隨后,通過對UCNPs摻雜的薄膜、有機熒光染料和UCNPs同時標記的細胞進行成像實驗,我們發(fā)現(xiàn)以UCNPs為發(fā)光探針的LSUCLM擁有很多獨特的優(yōu)勢,如對有機染料和UCNPs的光漂白均非常低,完全消除了來自內源性熒光物

7、質和同時標記的熒光染料的背景干擾,還可以與普通共聚焦熒光成像系統(tǒng)聯(lián)用等。
　　 4.放射性核素標記的稀土納米晶用于正電子發(fā)射斷層掃描(PET)和上轉換發(fā)光雙模式成像
　　 PET技術具有最高的活體成像靈敏度;而對細胞和組織顯像一般采用熒光成像方式。因此,開發(fā)同時具有放射性和熒光的探針可以構造出用于多尺度成像的顯像劑。
　　 我們利用18F-和稀土離子發(fā)生特異性結合反應的原理,發(fā)展了一個簡單、快速、高效的方法制備了