循環(huán)miR-189對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡的臨床診斷價(jià)值和意義.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus，SLE）是一種自身免疫性疾病，好發(fā)于育齡女性，而且老人和小孩的病例也有相關(guān)報(bào)道。但是，迄今為止，它的發(fā)病機(jī)制還不是很清楚。根據(jù)有關(guān)研究分析，可能的發(fā)病因素包括遺傳、環(huán)境、藥物及自身免疫系統(tǒng)功能的紊亂。涉及到的自身免疫功能紊亂主要體現(xiàn)在T、B 淋巴細(xì)胞比例的改變及功能的過度激活，產(chǎn)生的多種自身抗體與自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞和自身抗原反應(yīng)，造成組織損傷和正常功能破壞，引起疾

2、病的發(fā)生和發(fā)展。SLE是多器官、多組織損傷的疾病。臨床表現(xiàn)多樣，既可以系統(tǒng)出現(xiàn)，也可以某一臨床特征為突出特點(diǎn)，往往被誤診為其他疾病予以治療，延誤了疾病的早期治療，加快疾病的發(fā)展，造成組織和器官不可逆的損傷?？紤]到SLE 病理損害與臨床表現(xiàn)方面的特征，臨床對(duì)其診斷標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室診斷，特別是實(shí)驗(yàn)室診斷對(duì)疾病的診斷和治療療效評(píng)價(jià)具有不可替代的關(guān)鍵作用。高靈敏性、高通量的快速篩查技術(shù)有利于實(shí)驗(yàn)室診斷項(xiàng)目的開展和擴(kuò)大，有利于疾病早期

3、發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療。目前實(shí)驗(yàn)室對(duì)SLE和其他自身免疫性疾病篩查的主要項(xiàng)目是自身抗體譜的檢測(cè)，包括抗雙鏈DNA抗體（double standDNA，dsDNA）、抗單鏈DNA抗體（singAlstand DNA，ssDNA）、抗核抗體（anti-nuclearantibody，ANA）、抗可提取性核抗原（extractable nucler antigen，ENA）等?？筪sDNA抗體是SLE 最重要的診斷標(biāo)志之一，dsDNA與相應(yīng)

4、自身抗體形成的免疫復(fù)合物可導(dǎo)致皮下組織、腎臟和其它器官的損傷，而且自身抗體滴度與疾病的活動(dòng)具有相關(guān)性。此外，SLE的另一個(gè)標(biāo)志物抗史密斯（Smith，Sm）抗體也被認(rèn)為參與了病理過程。雖然這兩種自身抗體均具有較高特異性，但是敏感性都比較低，在臨床應(yīng)用上存在不足。所以目前已有很多研究正致力于探索特異性和可靠性更強(qiáng)的分子診斷標(biāo)記物作為自身抗體譜的補(bǔ)充或替代應(yīng)用于SLE的診斷。microRNA （miRNA）是大小約19-23個(gè)堿基的非編碼單

5、鏈小分子RNA，通過與靶基因3' 端非翻譯區(qū)（3'-UTR）的不完全堿基配對(duì)發(fā)揮基因調(diào)控的作用，抑制mRNA的翻譯。miRNA 廣泛參與了生物體多種生理和病理過程，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)和腫瘤生成等，通過表達(dá)量的上調(diào)或下調(diào)影響細(xì)胞的發(fā)育和疾病過程。一些miRNAs的表達(dá)譜具有細(xì)胞或組織特異性，而且在疾病發(fā)生時(shí)它們的表達(dá)量也發(fā)生特定的改變。最近有文獻(xiàn)報(bào)道外周血循環(huán)miRNA 可以作為腫瘤、心肌梗死、肝臟損傷等標(biāo)記物的研究，與疾

6、病進(jìn)程有密切關(guān)系。miRNA不同于其他小分子RNA，正常情況下表達(dá)量相對(duì)恒定，在血漿和血清中非常穩(wěn)定，不易被血液中的RNA 酶降解，在反復(fù)凍融和長期儲(chǔ)存的情況下仍能保持穩(wěn)定?；谂R床的需要和miRNA的特殊性質(zhì)，臨床是否可以用miRNA作為SLE的診斷標(biāo)志物達(dá)到輔助診斷的目標(biāo)？因此，本研究旨在檢測(cè)miRNA189(miR-189)在外周血中表達(dá)量的變化以及探討其對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡的診斷價(jià)值和意義。
　　 研究目的：探討血漿中miR

7、-189在SLE組和對(duì)照組間的表達(dá)量是否存在差異，以及循環(huán)miR-189對(duì)SLE潛在的診斷價(jià)值，是否可彌補(bǔ)自身抗體譜對(duì)SLE 診斷和療效評(píng)價(jià)中的不足。
　　 研究方法：1. 自身抗體的檢測(cè)對(duì)收集的三組血標(biāo)本進(jìn)行自身抗體譜的檢測(cè)，主要采用免疫的方法，其中抗dsDNA、抗ssDNA 檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme LinkedImmunoadsorbentassay，ELISA）間接法，抗ENA 檢測(cè)采用免疫印跡法，ANA

8、檢測(cè)采用間接免疫熒光法，按照操作說明檢測(cè)并觀察結(jié)果。2. 外周血miR-189的定量收集SLE患者血漿為疾病組(n=50)，包括穩(wěn)定期（n=13）和活動(dòng)期（n=37）。設(shè)立正常健康對(duì)照組（n=24）和疾病對(duì)照組（n=25），正常對(duì)照組為健康體檢者，排除自身免疫性疾病和機(jī)體各器官的器質(zhì)性病變；疾病對(duì)照組為各類自身免疫性疾病患者，包括白塞?。˙ehcet Disease，BD）（n=2），系統(tǒng)性硬化癥（System Sclerosis，SS

9、c）(n=1)，干燥綜合征（Sjogren's Disease，SS）(n=1)，多發(fā)性肌炎/皮肌炎（Polymyositis/ Dermatomyositis，PM/DM）(n=4)，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RheumatoidArthritis，RA）(n=7)，強(qiáng)直性脊柱炎（Ankylosing Spondylitis，AS）(n=5)，混合結(jié)締組織?。∕ixed Connective Tissue Disorder，MCTD）(n=5)。

10、各組之間年齡和性別統(tǒng)計(jì)無差異。采用ABI 公司研制RNA 抽提試劑盒抽提標(biāo)本總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用TaqMan 探針進(jìn)行Real-time PCR 相對(duì)定量檢測(cè)，比較觀察三組miR-189的表達(dá)量變化。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1．三組人群中抗體陽性率比較對(duì)ANA、抗dsDNA、抗Sm、抗Rnp和AnuA在三組人群中的陽性率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，SLE組中這五種抗體陽性率分別為98％、42％、28％、18％和24％，疾病對(duì)照組中陽性率為

11、19％、4％、0％、2％和1％，正常對(duì)照組均為0％。這五種抗體在SLE中的特異度分別為24％、84％、100％、92％和96％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抗dsDNA、抗Sm、抗Rnp和AnuA 特異性高，敏感性低，ANA 敏感性高，特異性低。2．三組人群中血漿miR-189表達(dá)量比較SLE組、疾病對(duì)照組、正常對(duì)照組三組血漿miR-189表達(dá)量比較，SLE組(26.8713±23.1291)高于疾病對(duì)照組（5.2281±4.4251）和正常對(duì)照組（3

12、.9908±4.0281），P值分別為0.0001，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，兩對(duì)照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。SLE組穩(wěn)定期（34.8932±27.4931）高于活動(dòng)期（24.0528±21.0898），p值為0.2885，統(tǒng)計(jì)學(xué)無差異。3. miR-189的相對(duì)定量與相關(guān)系數(shù)miR-189的相對(duì)定量（RQ）與SLE患者SLEDAI 評(píng)分的相關(guān)系數(shù)為r=0.009、p=0.968；miR-189的RQ與潑尼松使用劑量相關(guān)性系數(shù)為r=-0.2376、p=0

13、.1831；miR-189的RQ與抗ds-DNA 滴度相關(guān)系數(shù)為r=0.2607、p=0.2484，都沒有直接的相關(guān)性。4. miR-189對(duì)SLE的診斷價(jià)值分析與正常對(duì)照組比較，miR-189對(duì)SLE的診斷價(jià)值分析：ROC 曲線下面積0.888，面積標(biāo)準(zhǔn)誤為0.036，RQ 用于診斷SLE 有顯著意義（p=0.000），RQ值越大，診斷SLE的可能性越大。面積的95％可信區(qū)間(CI)為（0.817-0.960），不包括0.5。因此具有

14、診斷價(jià)值意義。miR-189對(duì)其他風(fēng)濕性疾病的診斷價(jià)值：ROC 曲線下面積為0.583，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.083。曲線與對(duì)角線重合，對(duì)其他風(fēng)濕性疾病沒有診斷價(jià)值。SLE組與疾病對(duì)照組比較，miR-189對(duì)SLE的鑒別診斷價(jià)值分析：ROC 曲線下面積0.847，面積標(biāo)準(zhǔn)誤0.043，RQ 用于鑒別診斷有顯著意義（p=0.000）。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：1．目前臨床上主要采用自身抗體譜對(duì)自身免疫性疾病包括SLE 達(dá)到臨床輔助診斷，從檢測(cè)結(jié)果看

15、自身抗體在敏感性和特異性達(dá)不到統(tǒng)一，敏感性高、特異性低則鑒別診斷不足而易誤診，特異性高、敏感性低則診斷效率差而易漏診，在臨床輔助診斷應(yīng)用上存在明顯的不足和缺陷。2．血漿游離miR-189在敏感性和特異性能達(dá)到相對(duì)統(tǒng)一，可以作為一個(gè)SLE的潛在診斷標(biāo)志物。雖然miR-189在SLE 活動(dòng)期和穩(wěn)定期都升高，表明該指標(biāo)對(duì)評(píng)價(jià)患者的疾病狀態(tài)和嚴(yán)重程度無輔助診斷價(jià)值，但可以用來補(bǔ)充現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室診斷指標(biāo)的不足，有助于SLE的早期診斷，使病人得到合理正