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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:白木香Aquilaria sinensis(Lour.) Gilg,又稱(chēng)土沉香、女兒香,來(lái)源于瑞香科沉香屬。白木香是我國(guó)傳統(tǒng)中藥沉香的唯一源植物,已經(jīng)被列為國(guó)家二級(jí)瀕危保護(hù)植物。國(guó)產(chǎn)沉香是白木香受物理化學(xué)的損傷或某些生物的刺激而產(chǎn)生的含樹(shù)脂的木材,是傳統(tǒng)名貴中藥材和天然香料,具有很高的藥用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值,但其自然積累過(guò)程需要漫長(zhǎng)的數(shù)十年,且品質(zhì)不可控。沉香形成過(guò)程及其結(jié)香機(jī)制至今尚未完全研究透徹,導(dǎo)致實(shí)際生產(chǎn)中尚無(wú)高效優(yōu)質(zhì)的人工結(jié)
2、香手段,同時(shí)源植物資源一直被掠奪式開(kāi)發(fā),因此市場(chǎng)上沉香供不應(yīng)求、價(jià)格居高不下。已有不少研究證實(shí)沉香的形成與內(nèi)生菌的感染有關(guān),但其研究思路都是依托實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法。本研究采用分子生物學(xué)方法,PCR-變性梯度凝膠電泳即PCR-DGGE(Denaturing gradient gelelectrophoresis,DGGE)技術(shù),以及末端限制性片段長(zhǎng)度多樣性即T-RFLP(Terminal-restriction fragment len
3、gth polymorphism, T-RFLP)技術(shù)對(duì)比白木香未結(jié)香白木及結(jié)香部位內(nèi)生菌的菌落結(jié)構(gòu)及多樣性,探討內(nèi)生菌對(duì)白木香結(jié)香的影響,為開(kāi)發(fā)更多更好的促進(jìn)結(jié)香的微生物提供科學(xué)依據(jù)。
方法:⑴為了避免外源性微生物的污染,用已消毒的生長(zhǎng)錐去掉取材部位的表層,取材后迅速放入已滅菌的采集袋,運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室-20℃保存?zhèn)溆?。⑵將各個(gè)樣品在超凈臺(tái)表面消毒后無(wú)菌環(huán)境晾干。用滅菌刀片刮去樣品表層組織,以防止外源性微生物DNA的污染,保證提
4、取的核酸來(lái)自植物組織內(nèi)部;同時(shí)剃除結(jié)香組樣品連帶的健康白木部分,保證結(jié)香組提取的微生物DNA來(lái)源于沉香。將處理好的樣品無(wú)菌環(huán)境液氮研末,置于無(wú)菌離心管備用。⑶各樣品總DNA提取采用植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行,具體操作參考按試劑盒使用說(shuō)明。⑷提取的總DNA點(diǎn)樣于1%的瓊脂糖凝膠,電泳檢測(cè)其片段大小,并用核酸蛋白儀測(cè)定DNA的濃度及質(zhì)量。⑸以樣品總DNA(稀釋液)為模板,擴(kuò)增引物都采用通用引物,且上游引物帶上GC夾,PCR完成后,產(chǎn)物1
5、.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè),合格后進(jìn)行DGGE電泳,掃描凝膠得到DGGE圖譜,合格后選取條帶編號(hào)割膠回收,回收條帶擴(kuò)增產(chǎn)物直接送檢測(cè)序。⑹以樣品總DNA(稀釋液)為模板,分別采用帶有FAM熒光基團(tuán)的細(xì)菌和真菌通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,割膠回收后膠回收試劑盒進(jìn)行純化。純化后的PCR產(chǎn)物分別用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切。酶切產(chǎn)物委托上?;瞪锛夹g(shù)有限公司進(jìn)行熒光掃描。
結(jié)果:無(wú)論是結(jié)香組還是未結(jié)香組,DGGE都分離得
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