MicroRNA-200c與非小細胞肺癌預后的相關性及其靶基因調控作用的研究.pdf

1、肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，在全世界范圍內其死亡率在男性及女性腫瘤中均位于第一位，是腫瘤相關死亡的首要原因。在美國，肺癌的發(fā)病率及死亡率近幾年來呈下降趨勢，但在我國，肺癌的發(fā)病率及死亡率仍在逐年上升，據國家癌癥中心2017年公布的最新統(tǒng)計數(shù)據（2013年）顯示，2013年全國新發(fā)惡性腫瘤病例數(shù)約368萬例，占世界的1/4(368萬/1409萬），與2012年相比，癌癥新發(fā)人數(shù)繼續(xù)上升，癌癥已經成為奪走人們健康甚至是生命的罪魁禍首之一，其

2、中肺癌仍然位于我國癌癥發(fā)病率和死亡率的第一位。
　　目前，肺癌的病因及發(fā)病機制仍未完全明確，吸煙、空氣污染、放射線暴露等都是肺癌發(fā)病的高危因素，其中吸煙（包括二手煙暴露）是肺癌的最重要的危險因素，煙草中包含的多種化學物質可以導致支氣管上皮細胞中的癌基因激活、抑癌基因失活，進而引起細胞的癌變。在我國，隨著工業(yè)的進一步發(fā)展，空氣污染、霧霾也是導致肺癌特別是女性肺腺癌高發(fā)的因素之一，而且呈現(xiàn)城市多于農村、女性腺癌患者較前明顯增加、年輕患

3、者較前明顯增加的趨勢。約75-80％的肺癌是非小細胞肺癌(NSCLC)，盡管近年來肺癌的治療手段如微創(chuàng)手術、精準放療、靶向治療、免疫治療、射頻消融治療等取得了長足的發(fā)展，但其總體5年生存率仍不高，約10-20％。
　　導致肺癌患者預后不良的主要原因是復發(fā)和轉移，約80％的肺癌患者在就診時就已經處于局部晚期或有遠處轉移，術后復發(fā)及轉移更是導致治療失敗或死亡的首要原因。隨著對肺癌的發(fā)生、發(fā)展以及肺癌細胞侵襲和轉移分子機制的深入研究，目

4、前已經發(fā)現(xiàn)并證實多種腫瘤分子標志物應用于臨床肺癌患者的早期檢測、腫瘤進展程度及治療效果的監(jiān)測和預后的判斷。而且研究發(fā)現(xiàn)，上皮間質轉化(EMT)在腫瘤細胞侵襲及轉移過程中發(fā)揮著重要的作用，是多種腫瘤（如肺癌、乳腺癌、結直腸癌等）轉移過程中的關鍵特征。上皮間質轉化過程涉及多種信號通路，其中包括E-鈣粘蛋白的表達缺失，這也是非小細胞肺癌轉移過程中的關鍵步驟。但是目前的各種肺癌腫瘤標志物敏感性及特異性仍不理想，因此有待研究發(fā)現(xiàn)更準確更實用的分子

5、標志物，并且希望對其進行調控來發(fā)現(xiàn)新的肺癌治療手段。
　　近年來，microRNA作為一類具有重要的潛在應用價值的治療及預后預測分子，其研究受到越來越多的重視。MicroRNA(mi RNA/miR)是由19～24個核苷酸組成的高度保守的非編碼短鏈RNA，主要通過與靶基因mRNA的3'-UTRs區(qū)域結合，使靶基因mRNA降解或抑制其翻譯過程，從而調控靶基因的表達。目前研究發(fā)現(xiàn)約1/3以上的人類基因受到miRNA的調控，一種miRN

6、A可以調控多達200個基因，同時一種基因也可以受多種miRNA共同調控。越來越多的證據表明，在不同的腫瘤中，miRNA的作用也不同，可以起到促進或抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。miRNA-200家族是近年來研究較為熱點的領域之一，已經證實在多種腫瘤中發(fā)揮著重要的作用。miRNA-200c是miRNA-200家族的成員之一，近期有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-200c在多種腫瘤中存在異常表達，且與腫瘤細胞的侵襲轉移及患者的預后相關。
　　為了進一步

7、探索miRNA-200c在非小細胞肺癌中所起的調控作用及與肺癌預后的關系，本課題擬從以下兩部分展開研究，第一部分:檢測miRNA-200c在非小細胞肺癌組織中的表達情況，分析其與患者各臨床病理指標之間的關系，并進行其與非小細胞肺癌患者預后的相關性研究;第二部分:預測miRNA-200c在非小細胞肺癌中的潛在靶基因，應用雙熒光素報告體系進行驗證，并進一步在肺癌細胞系中驗證其調控作用，探索調控機制。
　　第一部分:microRNA-2

8、00c與非小細胞肺癌預后的相關性研究
　　目的:檢測非小細胞肺癌組織中miRNA-200c的表達水平，分析miRNA-200c表達與非小細胞肺癌患者臨床病理特征及預后的相關性，從而探討miRNA-200c在非小細胞肺癌中的表達與預后判定中所起的作用及其臨床意義。
　　方法:收集自2008年1月至2008年12月期間，在山東大學齊魯醫(yī)院胸外科行肺癌根治性切除+系統(tǒng)性淋巴結清掃術的原發(fā)性非小細胞肺癌患者組織標本110例，采用PC

9、R基因擴增技術檢測miRNA-200c的表達水平，收集所有患者的臨床病理資料，包括年齡、性別、吸煙史、組織學類型、腫瘤分化程度、腫瘤大小、淋巴結轉移情況、TNM分期，并對患者進行嚴格隨訪，將以上指標建立數(shù)據庫。應用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，應用卡方檢驗分析miRNA-200c與患者臨床病理指標之間的關系，應用Kaplan-Meier法繪制患者的生存曲線，應用Logrank檢驗比較患者的生存差別及有無統(tǒng)計學意義，應用Cox回歸多

10、因素分析判定獨立預后因素。
　　結果:非小細胞肺癌組織中miRNA-200c的表達水平顯著上調，110例肺癌組織中，66例miRNA-200c呈高表達，44例呈低表達。miRNA-200c的高表達與肺癌淋巴結轉移顯著相關(P＜0.05)。術后無病生存率及總生存率的單因素分析結果顯示:miRNA-200c高表達患者的無病生存率及總生存率均顯著低于miRNA-200c低表達患者(15.2％ versus25.0％，P=0.004;21

11、.2％versus50.0％，P=0.000);有淋巴結轉移的患者其無病生存率及總生存率顯著低于無淋巴結轉移的患者(9.3％versus28.6％，P=0.000;13.0％ versus51.8％，P=0.000); TNM分期越晚的患者其無病生存率及總生存率顯著低于TNM分期早的患者(0％ versus15.6％ versus30.4％，P=0.011;0％ versus24.4％ versus54.3％，P=0.002)。術后無病

12、生存率及總生存率的多因素分析結果顯示: miRNA-200c的表達水平及TNM分期分別是判定原發(fā)性非小細胞肺癌患者術后無病生存率(P=0.030，P=0.000)及總生存率(P=0.006，P=0.000)的獨立危險因素。
　　結論:1.miRNA-200c在非小細胞肺癌組織中存在高表達;miRNA-200c高表達與肺癌淋巴結轉移密切相關;2.miRNA-200c高表達與非小細胞肺癌患者術后復發(fā)、轉移以及不良預后密切相關，miRN

13、A-200c可作為評估非小細胞肺癌患者預后的有效的分子標志物。
　　第二部分:mieroRNA-200c在非小細胞肺癌中的潛在靶基因及其調控作用的研究
　　目的:篩選并驗證miRNA-200c在非小細胞肺癌的轉移及預后中至關重要的潛在靶基因，并對其調控作用及調控機制進行進一步探索。
　　方法:首先應用生物信息學分析數(shù)據庫（TargetScan; microRNA.org; PicTar）對miRNA-200c所調控的潛

14、在靶基因及結合位點進行預測和評分，結合文獻檢索，選定待研究的靶基因，合成靶基因的3'UTR調控序列并插入pcDNA3.1(+)-luciferase載體，在人胚胎腎293細胞系(HEK-293)中應用雙熒光素報告體系驗證選定的靶基因。然后應用RT-PCR技術進一步在非小細胞肺癌組織標本中檢測靶基因mRNA的表達情況。最后應用細胞轉染技術在肺癌細胞系(A549)中上調和下調miRNA-200c的表達水平，應用Western-blot法檢測

15、靶基因在蛋白水平的表達變化，應用RT-PCR檢測靶基因在mRNA水平的表達變化，驗證miRNA-200c在肺癌細胞系中對靶基因的調控作用，并分析調控機制。
　　結果:通過生物信息學數(shù)據庫的預測結果，結合文獻檢索，選取miRNA-200c的潛在靶基因ATRX、HFE和DLC1進行進一步驗證和功能研究。應用雙熒光素酶報告檢測法成功驗證靶基因。進一步檢測非小細胞肺癌組織中靶基因ATRX、HFE和DLC1 mRNA的表達，結果顯示ATRX

16、、HFE和DLC1的mRNA表達水平均顯著降低(P＜0。05)。在A549肺癌細胞系中上調miRNA-200c的表達，發(fā)現(xiàn)ATRX、HFE和DLC1的蛋白表達水平均顯著下降，ATRX和HFE的mRNA表達水平顯著下降，而DLC1的mRNA表達水平無明顯差異;下調miRNA-200c的表達，發(fā)現(xiàn)ATRX、HFE和DLC1的蛋白表達水平均顯著提高，ATRX和HFE的mRNA表達水平顯著提高，而DLC1的mRNA表達水平無明顯差異。證實了mi

17、RNA-200c在肺癌細胞系中通過不同的作用機制對靶基因起調控作用，對ATRX和HFE的調控體現(xiàn)在mRNA水平，對DLC1的調控體現(xiàn)在蛋白水平。
　　結論:1.在非小細胞肺癌中，miRNA-200c可以調控靶基因ATRX、HFE和DLC1的表達。2.在A549肺癌細胞系中，miRNA-200c通過不同的作用機制調控靶基因的表達，根據研究結果推論，miRNA-200c通過降解ATRX和HFE的mRNA來下調其表達，通過抑制DLC1