外源ABA提高甘蔗抗寒性的生理及分子機(jī)制研究.pdf

1、甘蔗是中國(guó)乃至世界第一大糖料作物，起源于熱帶及亞熱帶地區(qū)，屬喜溫作物。近年來(lái)，世界范圍內(nèi)極端天氣頻發(fā)，寒害、凍害增多，這給甘蔗生產(chǎn)造成了巨大的損失。在生產(chǎn)上，甘蔗防寒抗凍的措施主要有推廣應(yīng)用抗寒性好的品種、改善栽培管理措施及化學(xué)調(diào)控等。脫落酸(ABA)在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆脅迫生長(zhǎng)中具有重要的作用。本研究采用土培和水培兩種方式種植不同抗寒性的甘蔗品種GT28和YL6，在低溫脅迫前12h用ABA進(jìn)行處理，研究低溫脅迫下ABA提高甘蔗抗寒性

2、的生理生化機(jī)制，并利用熒光定量PCR技術(shù)、雙向電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)，探討ABA提高甘蔗抗寒性的分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.低溫脅迫下外源ABA對(duì)甘蔗幼苗生理生化特性的影響
　　 低溫脅迫改變甘蔗幼苗葉片的生理生化特性。低溫脅迫后，兩個(gè)甘蔗品種幼苗葉片細(xì)胞膜透性增大;丙二醛(MDA)和脯氨酸含量增加;光合相關(guān)指標(biāo)凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度(Gs)和蒸騰速率（Tr）降低，而胞間CO2(Ci)則表現(xiàn)相反，濃度升高;

3、葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)、光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)和PSⅡ?qū)嶋H量子效率(ΦPSⅡ)均降低，而初始熒光(Fo)和非光化學(xué)猝滅系數(shù)(NPQ)則升高;內(nèi)源激素赤霉素(GA)和玉米素(ZR)含量下降，ABA含量升高，導(dǎo)致ABA/GA、ABA/IAA和ABA/ZR比值增大。低溫脅迫下甘蔗幼苗脯氨酸、ABA和GA含量及ABA/GA比值存在基因型差異，抗寒性強(qiáng)品種脯氨酸、ABA含量和ABA/GA比值較高，GA含量較低，這是引起兩個(gè)甘

4、蔗品種不同抗寒性的重要生理基礎(chǔ)。ABA處理后，有效緩解了低溫脅迫對(duì)甘蔗的不利效應(yīng)，使兩個(gè)甘蔗品種幼苗葉片細(xì)胞膜、Pn、光系統(tǒng)Ⅱ、葉綠素含量相對(duì)穩(wěn)定，降低了膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA和GA的含量，提高了脯氨酸、ABA含量和ABA/GA比值，從而提高兩個(gè)甘蔗品種幼苗的抗寒性。
　　 2.低溫脅迫下ABA及其合成抑制劑對(duì)甘蔗幼苗抗氧化酶活性的影響
　　 低溫脅迫下，甘蔗幼苗抗氧化酶的活性提高。ABA處理的甘蔗幼苗ABA含量提高，抗氧

5、化保護(hù)酶超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)、谷胱甘肽還原酶(GR)的活性提高，活性氧自由基超氧陰離子(O2-)、過(guò)氧化氫(H2O2)及膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量下降，而ABA合成抑制劑鎢酸鈉處理的結(jié)果則與之相反。這說(shuō)明ABA及其合成抑制劑鎢酸鈉處理對(duì)低溫脅迫下甘蔗幼苗抗氧化保護(hù)系統(tǒng)具有重要的調(diào)節(jié)作用。ABA對(duì)低溫脅迫下甘蔗抗寒性的增強(qiáng)，可能與它對(duì)抗氧化保護(hù)系統(tǒng)的誘導(dǎo)密切相關(guān)。

6、
　　 3.低溫脅迫下ABA處理對(duì)甘蔗幼苗葉片蛋白質(zhì)表達(dá)的影響
　　 低溫脅迫影響甘蔗幼苗葉片蛋白質(zhì)表達(dá)。利用蛋白質(zhì)雙向電泳分析，找出兩個(gè)甘蔗品種低溫脅迫和ABA處理下差異蛋白點(diǎn)48個(gè)，質(zhì)譜成功鑒定其中29個(gè)。將它們按不同功能分為7類(lèi):①參與光合作用7個(gè)，占24.1％，包括光系統(tǒng)Ⅱ穩(wěn)定因子、葉綠體a-b結(jié)合蛋白、鐵氧還蛋白-NADP-氧化還原酶、核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶小亞基、光系統(tǒng)Ⅰ反應(yīng)中心亞基、23 kD多

7、肽光合系統(tǒng)Ⅱ、葉綠體Ptr-ToxA結(jié)合蛋白;②參與抵御脅迫保護(hù)酶7個(gè)，占24.1％，包括乙二醛酶、抗壞血酸過(guò)氧化物酶、硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶、M型硫氧還蛋白、醌還原酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶;③參與蛋白加工6個(gè)，占20.7％，包括20 S蛋白酶體、30S核糖體蛋白、60 S酸性核糖體蛋白、FKBP型肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶、BRⅡ-KD互作蛋白、肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶;④參與基礎(chǔ)代謝6個(gè)，占20.7％，包括谷草轉(zhuǎn)氨酶、葉綠體醛縮酶、

8、硫胺合成酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、果糖-1，6-二磷酸醛縮酶前體、ATP合酶6亞基;⑤參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控1個(gè)，占3.4％，為真核翻譯起始因子5A;⑥參與細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂1個(gè)，占3.4％，為生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白;⑦未知功能蛋白1個(gè)，占3.4％，為假定蛋白。對(duì)其中10個(gè)編碼差異蛋白質(zhì)的基因mRNA的表達(dá)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)它們?cè)谵D(zhuǎn)錄水平與蛋白水平上的變化不一，相關(guān)性不高。進(jìn)一步分析已鑒定蛋白的功能發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫通過(guò)蛋白質(zhì)表達(dá)主要影響甘蔗了的光合作用和抗氧化保護(hù)系統(tǒng)

9、，這也與生理參數(shù)的變化相符。ABA處理后，經(jīng)過(guò)一系列蛋白的加工和折疊作用，穩(wěn)定了光合系統(tǒng)，加強(qiáng)了抗氧化保護(hù)作用，從而提高植物抗寒性。
　　 4.抗寒相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析
　　 利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了5個(gè)抗寒相關(guān)基因，獲得了甘蔗抗壞血酸過(guò)氧化物酶基因cDNA全長(zhǎng)1045 bp、甘蔗谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因cDNA全長(zhǎng)912 bp、甘蔗ABA脅迫蛋白基因cDNA全長(zhǎng)753 bp、甘蔗鐵氧還蛋白-NADP還原

10、酶基因cDNA全長(zhǎng)為1335 bp及甘蔗脫水素基因cDNA全長(zhǎng)578 bp。成功構(gòu)建了這5個(gè)基因的原核表達(dá)載體，獲得了它們?cè)诖竽c桿菌中的融合表達(dá)蛋白。通過(guò)熒光定量PCR分析了SoAP、SoGST、SoASR、SoFNR和SoDHN的mRNA在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，結(jié)果表明兩個(gè)甘蔗品種在對(duì)抗寒基因的表達(dá)調(diào)控上存在明顯差異。SoAPX基因在抗寒性強(qiáng)的GT28中高表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)于抗寒性弱的YL6;SoGST基因在抗寒性強(qiáng)的GT28中啟動(dòng)要快于抗寒性弱的

11、YL6;SoASR基因在抗寒性強(qiáng)的GT28中表達(dá)上調(diào)，并在脅迫1d時(shí)表達(dá)量最高，而在抗寒性弱的YL6中表達(dá)則下調(diào);SoDHN基因在抗寒性強(qiáng)的GT28中增幅明顯，最大增幅達(dá)到1200.6％，而在抗寒性弱的YL6中最大增幅僅為38.9％?？梢?jiàn)低溫脅迫下甘蔗抗寒相關(guān)基因表達(dá)的差異直接影響了基因型間的抗寒性。ABA處理后，這5個(gè)基因在兩個(gè)甘蔗品種中都不同程度地被誘導(dǎo)，使得ABA信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用增強(qiáng)，甘蔗自身的抗氧化防護(hù)能力提高，膜的結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，