大豆灰斑病抗性鑒定方法及轉(zhuǎn)BnERF104大豆的灰斑病抗性研究.pdf

1、大豆灰斑病世界性分布,是我國(guó)大豆主產(chǎn)區(qū)的重要病害,尤以東北三省危害嚴(yán)重。目前防治灰斑病主要通過(guò)利用抗病品種和化學(xué)農(nóng)藥防治。化學(xué)農(nóng)藥的使用費(fèi)用和殘留及藥害等問(wèn)題使得化學(xué)防治只能作為應(yīng)急措施；而種植抗病品種的防治技術(shù)成本低,是基礎(chǔ)的、主要的防治技術(shù)。然而,灰斑病生理小種易發(fā)生變化,導(dǎo)致品種喪失抗性,因此,培育廣譜持久抗病品種是當(dāng)前的迫切需要。其途徑有兩條:一、從已有大豆品種中鑒定發(fā)掘；二、利用基因工程技術(shù)導(dǎo)入具有廣譜抗性的基因。后者可通過(guò)激

2、活植株防衛(wèi)反應(yīng),如超表達(dá)某個(gè)轉(zhuǎn)錄因子激活防衛(wèi)反應(yīng)下游基因的表達(dá),從而有效提高品種的廣譜持久抗病性。
　　 不管是在現(xiàn)有大豆資源中篩選,還是通過(guò)轉(zhuǎn)基因創(chuàng)造培育主效+廣譜的持久抗病品種,都需要一個(gè)高效、準(zhǔn)確的抗病性鑒定方法。目前大豆灰斑病的鑒定大多采用田間孢子接種法,該方法存在時(shí)間長(zhǎng)、易受環(huán)境和接種條件等因素的影響、鑒定結(jié)果重復(fù)性差等缺點(diǎn)。因此,迫切需要建立室內(nèi)快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、可區(qū)分對(duì)單個(gè)小種抗性的大豆灰斑病抗性鑒定方法。本研

3、究首先探討建立能夠滿足上述研究需求的抗病性鑒定方法,在此基礎(chǔ)上,通過(guò)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)錄因子BnERF104探討提高大豆灰斑病廣譜抗病性。獲得的主要結(jié)果如下:
　　 1.大豆灰斑病菌絲塊離體葉接種快速鑒定方法建立
　　 利用大豆灰斑病菌1號(hào)和7號(hào)生理小種,6個(gè)抗性不同的大豆材料,研究了大豆灰斑病抗性的菌絲塊離體葉接種快速鑒定方法。結(jié)果表明,在28℃、200μE·m-2·s-1光照強(qiáng)度和12h光照／12h黑暗條件下,將Minimal培

4、養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌絲塊分別接種抗、感大豆葉片,病斑面積在不同的材料之間差異明顯,其鑒定結(jié)果與已報(bào)道的這些品種抗性水平一致。該鑒定方法具有不受生育期和環(huán)境條件限制、重復(fù)性強(qiáng)、可區(qū)分單個(gè)生理小種抗性等優(yōu)點(diǎn),是大豆灰斑病抗性室內(nèi)鑒定的一種有效方法。
　　 2.轉(zhuǎn)BnERF104大豆植株的獲得
　　 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將表達(dá)載體OX-BnERF104轉(zhuǎn)化大豆(東農(nóng)50)子葉節(jié),通過(guò)芽的再生、芽的伸長(zhǎng)、生根、移栽等階段,獲得轉(zhuǎn)基因再生植株

5、。在芽伸長(zhǎng)過(guò)程中,通過(guò)噴施20mg／L BASTA的方法可以有效地對(duì)再生芽進(jìn)行篩選。大豆再生芽的生根,牢較低,一直是轉(zhuǎn)化植株獲得的瓶頸。在生根培養(yǎng)基中用特美汀代替頭孢,添加0.1％的活性炭和將IBA濃度提高到2mg／L能顯著的提高再生芽不定根的發(fā)生。通過(guò)PCR鑒定,共獲得20株T1代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。熒光定量PCR結(jié)果顯示,部分轉(zhuǎn)基因大豆中BnERF104的表達(dá)量顯著上調(diào)。
　　 3轉(zhuǎn)基因植株對(duì)大豆灰斑病抗性鑒定
　　 對(duì)