新型微試樣黏度檢測(cè)裝置及其在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用.pdf

1、流體黏性的檢測(cè)在生物醫(yī)學(xué)，化學(xué)，材料等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。例如，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，基礎(chǔ)及臨床研究顯示體液黏性與許多疾病密切相關(guān)：心腦血管病患者與正常人相比，血液表觀黏度有顯著的變化；退行性關(guān)節(jié)病，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病引起關(guān)節(jié)滑膜液的黏性改變等。目前許多研究涉及到各種類型的生物體液，例如小型動(dòng)物體液獲取困難，代價(jià)很高，降低黏性檢測(cè)中的樣品消耗尤為重要。
　　另一方面，黏度也可能影響到腫瘤細(xì)胞的黏附行為。黏度是微粒分散體系中粒子的沉降速率的決定因素之一

2、，對(duì)于多相流體，當(dāng)微粒的密度大于分散介質(zhì)的密度，就會(huì)發(fā)生沉降，根據(jù)Stokes定律，黏度越大，沉降速度越小，懸浮液中的粒子越穩(wěn)定，越不易發(fā)生沉降。而腫瘤細(xì)胞在血管壁的黏附可以簡(jiǎn)化成一個(gè)粒子在血液中沉降—與管壁接觸—黏附的過(guò)程，在這一過(guò)程中，黏度可能影響到血流中接觸到管壁的腫瘤細(xì)胞數(shù)，因此，黏度對(duì)腫瘤細(xì)胞黏附行為的影響是值得考察的。
　　此外，由于微流控裝置具備微型化、集成化的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用在生物技術(shù)，化學(xué)化工等領(lǐng)域。如何在

3、微小的芯片內(nèi)精確地掌控流體的運(yùn)動(dòng)形態(tài)是微流控技術(shù)的最為基礎(chǔ)而重要的一環(huán)。而黏度，作為一項(xiàng)基本的流變學(xué)參數(shù)，對(duì)分析流體的運(yùn)動(dòng)行為是極為關(guān)鍵的。因此，為了滿足微流控實(shí)驗(yàn)微量化的樣品需求，高效的測(cè)量實(shí)驗(yàn)所涉及的流體黏度便成為現(xiàn)代黏性測(cè)量技術(shù)的主要課題之一。
　　然而，現(xiàn)有微試樣黏度計(jì)的研究面臨著一些瓶頸：
　　（1）由于尺度的縮小，末端效應(yīng)、表面張力等在宏觀尺度下可忽略的效應(yīng)陡然增大，并導(dǎo)致了顯著的誤差。這使得現(xiàn)有微試樣黏度計(jì)的測(cè)

4、量準(zhǔn)確度普通較低，尤其是在低剪切率的條件下測(cè)量低黏度的樣品時(shí)這一問(wèn)題尤為突出（誤差：5％~24%）。
　?。?）盡管現(xiàn)有的微試樣黏度計(jì)芯片本身樣品容積量很小，但為了驅(qū)動(dòng)流體進(jìn)行檢測(cè)，需要連接容積量很大的泵和導(dǎo)管，因此總的樣品消耗量仍然居高不下。
　?。?）同樣由于尺度的縮小，通道的表面粗糙度過(guò)大會(huì)給流動(dòng)造成明顯的擾動(dòng)導(dǎo)致宏觀流體力學(xué)的失效。因此，微試樣黏度計(jì)的制作需要嚴(yán)格控制通道的表面粗糙度，要求更為嚴(yán)格的制作工藝，這使得系

5、統(tǒng)搭建及制作成本很高。
　?。?）由于芯片體積小樣品少，熱容量小，對(duì)環(huán)境溫度變化特別敏感，這對(duì)測(cè)量環(huán)境的溫度控制提出了更嚴(yán)格的要求。而現(xiàn)有的微試樣黏度計(jì)未能很好地解決這一問(wèn)題?；谏鲜鲈?，現(xiàn)有的微試樣黏度計(jì)一直未能得到商業(yè)化的運(yùn)用。因此，提供更加精確、穩(wěn)定、微試樣的黏性測(cè)量方法，為科研工作者提供可靠的流體黏度數(shù)據(jù)，是論文所需完成的主要目標(biāo)。
　　本文提出了一種高效、精確、微試樣低成本的微流控黏性檢測(cè)芯片（后簡(jiǎn)稱為芯片黏度計(jì)

6、），可以用于生物類流體的黏度測(cè)量。在對(duì)末端效應(yīng)、表面張力、動(dòng)能修正項(xiàng)等引入的誤差進(jìn)行評(píng)估后，研究者對(duì)芯片的構(gòu)型及尺寸進(jìn)行了優(yōu)化：通道的兩端加入了一對(duì)匹配的光滑圓管，幾乎完全避免了表面張力的影響。芯片的尺寸通過(guò)誤差分析決定，優(yōu)化后的芯片誤差被嚴(yán)格控制在0.5%以下，且每次測(cè)量消耗量?jī)H為200μl。本文采用自制的配套模具，結(jié)合抽絲法，能夠輕易地在芯片內(nèi)部形成表面光滑的圓管，適應(yīng)了通道表面粗糙度需要嚴(yán)格控制的加工需求。為了保證測(cè)量環(huán)境的溫度恒

7、定，本文為芯片黏度計(jì)設(shè)計(jì)了一套專門(mén)的測(cè)量平臺(tái)。測(cè)試時(shí)，芯片置于特制的恒溫水浴槽中，樣本流體加載于芯片的上游儲(chǔ)液池中，被外部壓力控制裝置驅(qū)動(dòng)，樣品通過(guò)主通道后流入到下游儲(chǔ)液池中。測(cè)試流體在黏度測(cè)量芯片內(nèi)的流動(dòng)狀態(tài)通過(guò)CCD對(duì)儲(chǔ)液池的液面流動(dòng)情況進(jìn)行記錄，并利用一段圖像處理程序?qū)σ曨l進(jìn)行處理。通過(guò)程序自動(dòng)提取運(yùn)動(dòng)軌跡信息、自動(dòng)輸出黏度值，不但使操作更簡(jiǎn)單，又減少了人為因素引入的誤差，使測(cè)量結(jié)果具有良好的復(fù)現(xiàn)性。
　　相較于其他微試樣黏

8、度計(jì)，本文研制的芯片黏度計(jì)結(jié)果更加準(zhǔn)確：通過(guò)將本文所研制的芯片黏度計(jì)與美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)局（NIST）公布的參考值，傳統(tǒng)毛細(xì)管黏度計(jì)，傳統(tǒng)旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)進(jìn)行橫向比對(duì)，可以看出芯片黏度計(jì)的測(cè)量結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值、傳統(tǒng)烏氏黏度計(jì)測(cè)量值三者吻合良好，相對(duì)誤差小于2%。本文還根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織以及國(guó)際電工委員會(huì)（ISO/IEC）發(fā)布的《測(cè)量不確定度評(píng)估指南》對(duì)芯片黏度計(jì)進(jìn)行完整的不確定度評(píng)估，計(jì)算其擴(kuò)展相對(duì)不確定度 U95=2.2%，較主流的微試樣黏度芯片準(zhǔn)確

9、度提高了2倍以上。
　　在芯片黏度計(jì)制作完成后，本論文為了考察黏度與腫瘤細(xì)胞黏附行為的關(guān)系，本文還設(shè)計(jì)構(gòu)建了一個(gè)理想化的HepG2細(xì)胞黏附模型，用于模擬腫瘤細(xì)胞在人體血管環(huán)境里的黏附行為。在此模型中，本文綜合考慮了黏度、流場(chǎng)等力學(xué)因子對(duì)腫瘤細(xì)胞黏附行為產(chǎn)生的影響。首先，本文通過(guò)有限元分析預(yù)測(cè)了芯片模型中的流場(chǎng)、紊流分布強(qiáng)度等信息，在此基礎(chǔ)上，我們通過(guò)三組對(duì)比實(shí)驗(yàn)考察了黏度、細(xì)胞密度以及它們與流場(chǎng)之間的相互作用對(duì)芯片底面 HepG2

10、細(xì)胞黏附數(shù)量產(chǎn)生的影響。
　　研究結(jié)果表明，當(dāng)血管分岔角增大時(shí)，紊流強(qiáng)度也增大。流場(chǎng)中紊流的增加能有效的提高芯片底面黏附的HepG2細(xì)胞數(shù)量，但黏附細(xì)胞的總數(shù)受芯片底部管壁容納極限的影響，因此紊流強(qiáng)度達(dá)到一定程度后，黏附細(xì)胞數(shù)逐漸趨于穩(wěn)定不再繼續(xù)增大。增加細(xì)胞密度相當(dāng)于增加細(xì)胞與底面接觸的幾率，也能起到增加底面黏附細(xì)胞數(shù)的效果，其作用效果在低紊流環(huán)境下格外顯著。而流體黏度對(duì)底面黏附細(xì)胞數(shù)的影響較為復(fù)雜，對(duì)于不同紊流環(huán)境其效果相差較

11、大，一方面黏度增大了流動(dòng)阻力，降低了HepG2細(xì)胞的移動(dòng)速度，增加了HepG2細(xì)胞在底面黏附的可能性；另一方面，黏度的增加降低了HepG2的沉降速度，更多的HepG2懸浮在溶液中，不與管壁接觸。因此，在黏附能力較弱的低紊流環(huán)境下，這兩個(gè)因素互相抵消，黏附細(xì)胞數(shù)保持穩(wěn)定。而在黏附能力較強(qiáng)的高紊流環(huán)境里，后者的影響占主要，因此黏度增加，芯片底部的黏附細(xì)胞數(shù)大幅度降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與我們的預(yù)期吻合較好。
　　本文所研制的芯片黏度計(jì)還具有樣品

12、消耗量小，制造簡(jiǎn)單，成本低廉，操作方便且易于維護(hù)的優(yōu)勢(shì)。它基于抽絲法構(gòu)建，與傳統(tǒng)的軟蝕刻技術(shù)相比，不需要依賴各種昂貴設(shè)備和器材。僅利用微絲和自制的配套模具，將毛細(xì)管，儲(chǔ)液池，壓力接口全部整合于一塊芯片中，一方面大幅度的降低了制造成本，另一方面又避免了各部件的連接和密封不良可能導(dǎo)致的漏液，減少了連接部位產(chǎn)生的壓降損失從而降低了誤差。由于價(jià)格低廉，它可以作為一次性用品以避免芯片之間的樣品污染，也可以多次清洗重復(fù)使用進(jìn)一步降低成本。本黏性測(cè)量