甲狀腺激素受體新亞型TRβ△的轉(zhuǎn)錄活性以及P-box氨基酸序列與TRβ△轉(zhuǎn)錄激活作用關(guān)系的研究.pdf

1、目的：
　　 研究甲狀腺激素受體新亞型TRβ△通過甲狀腺激素應(yīng)答元件(thyroidresponse element，TRE)增強靶基因轉(zhuǎn)錄的作用，判斷TRβ△是否具有轉(zhuǎn)錄因子活性。利用兩種突變方式改變TRβ△的DBD(DNA-binding domain，DBD)中P-box的氨基酸序列，分析TRβ△在突變之后是否仍具有與DNA結(jié)合后開啟轉(zhuǎn)錄激活作用的功能。從而闡明保持DBD中P-box氨基酸序列的保守性對于TRβ△受體結(jié)合D

2、NA和激活轉(zhuǎn)錄的功能的重要性。
　　 方法：
　　 利用基因重組技術(shù)，分別以pETDuet-TRβ1和pETDuet-TRβ△為模板，擴增TRβ1和TRβ△的cDNA插入到載體pcDNA3.1中，構(gòu)建pcDNA3.1-TRβ1和pcDNA3.1-TRβ△真核表達載體。設(shè)計一對特異引物，利用定向突變技術(shù)，將作為TRE類型之一的PAL(palindromic)TRE，即回文序列TRE插入到載體pGL3-Promoter中，構(gòu)

3、建含有PAL的pGL3-Promoter報告基因載體。將pcDNA3.1-TRβ1和pcDNA3.1-TRβ△分別與含有PAL的pGL3-Promoter報告基因載體瞬時共轉(zhuǎn)染至COS-7細胞中，并用加有T3的培養(yǎng)基和不加T3的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞后，檢測熒光素酶的活性。同時設(shè)立pcDNA3.1-TRβ△和pcDNA3.1-TRβ1與不含PAL的pGL3-Promoter共轉(zhuǎn)染及含有PAL的pGL3-Promoter單獨轉(zhuǎn)染的對照組。利用定向

4、點突變技術(shù)，將pcDNA3.1-TRβ△的DBD中P-box氨基酸序列分別通過突變改換不同的氨基酸。突變后產(chǎn)生的蛋白和其與RXR蛋白雜二聚化后的復(fù)合物分別與標記后的DR4進行EMSA實驗。突變后的載體分別與含有PAL的pGL3-Promoter報告基因載體瞬時共轉(zhuǎn)染至COS-7細胞中，并用加有T3的培養(yǎng)基和不加T3的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞后，檢測熒光素酶的活性。
　　 結(jié)果：
　　 PCR證實成功構(gòu)建了pcDNA3.1-TRβ1

5、和pcDNA3.1-TRβ△真核表達載體，測序及酶切結(jié)果完全正確。雙酶切及測序證實成功構(gòu)建了含有PAL的pGL3-Promoter報告基因載體。pcDNA3.1-TRβ1和pcDNA3.1-TRβ△分別與含有PAL的pGL3-Promoter報告基因載體瞬時共轉(zhuǎn)染48小時后，可以檢測到很強的熒光素酶比活性，而且pcDNA3.1-TRβ1與含有PAL的pGL3-Promoter共轉(zhuǎn)染后用加有T3的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，同時間點的熒光素酶比活性(

6、RLUs/mg蛋白)比不加T3的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞升高至16倍，pcDNA3.1-TRβ△與含有PAL的pGL3-Promoter共轉(zhuǎn)染后用加有T3的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，熒光素酶比活性升高至14倍。測序證實成功構(gòu)建了pcDNA3.1-TRβ△Amut1突變P-box，將DBD中P-box的第三位氨基酸P突變?yōu)镚，突變后的P-box的氨基酸序列變?yōu)榕cTRβ1一致的CEGCKG。成功構(gòu)建了pcDNA3.1-TRβ△mut2突變P-box，將DBD

7、中P-box的氨基酸序列最重要的兩個氨基酸EG突變?yōu)镚A，突變后的P-box的氨基酸序列變?yōu)镃GACKP。TRβ△mut1蛋白和其與RXR蛋白雜二聚化后的復(fù)合物均可與標記后的DR4結(jié)合。而TRβ△maut2蛋白自身不能與DR4結(jié)合，但RXR可與DR4結(jié)合，所以TRβ△mut2蛋白與RXR蛋白雜二聚化后才可與標記后的DR4結(jié)合。pcDNA3.1-TRβ△mut1和pcDNA3.1-TRβ△mut2分別與含有PAL的pGL3-Promote

8、r報告基因載體瞬時共轉(zhuǎn)染48小時后，檢測熒光素酶比活性，發(fā)現(xiàn)前者熒光素酶比活性是后者的7倍，兩者同時間點的熒光素酶比活性比不加T3的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞分別升高至7倍和2.5倍。
　　 結(jié)論：
　　 1.新發(fā)現(xiàn)的甲狀腺激素受體亞型TRβ△與已發(fā)現(xiàn)的TRβ1一樣能通過甲狀腺激素應(yīng)答元件增強靶基因轉(zhuǎn)錄。
　　 2.結(jié)果顯示報告基因表達水平均可被T3提高。證實TRβ△是一個受配體(T3)誘導(dǎo)的功能性的轉(zhuǎn)錄因子。
　　

9、 3.新發(fā)現(xiàn)的甲狀腺激素受體亞型TRβ△的DBD中P-box氨基酸序列與TRβ1的原始DBD中P-box氨基酸序列均與轉(zhuǎn)錄激活作用有關(guān)，把TRβ△受體的P-box氨基酸序列CEGCKP變?yōu)楹蚑Rβ1一致的CEGCKG，在其后比TRβ1多30幾個氨基酸的情況下仍可通過TRE對報告基因產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄激活作用，報告基因表達水平均可被T3提高，TRβ△mut1蛋白和其與RXR蛋白雜二聚化后的復(fù)合物均可與標記后的DR4結(jié)合。但是改變了DBD P-bo