油菜抗菌核病分子機(jī)制研究.pdf

1、由核盤菌(Sclertinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)引起的菌核病是油菜的一種最主要的病害。目前高抗材料缺乏、油菜抗菌核病的分子機(jī)制尚不清楚，尚未找到關(guān)鍵的抗病基因。目前世界各國(guó)的研究者以擬南芥等模式植物為對(duì)象，已經(jīng)構(gòu)建了植物病害防御反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)或分子機(jī)制，這個(gè)網(wǎng)絡(luò)主要由氧爆發(fā)(OB)途徑、水楊酸途徑和茉莉酸途徑所構(gòu)成，其中氧爆發(fā)途徑，包括H2O2的產(chǎn)生是植物防御反應(yīng)的一個(gè)早期事件。
　　 本

2、研究首先調(diào)查了病害防御反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)分子甲基茉莉酸(MeJA)和苯丙噻重氮(BTH，水楊酸類似物)和菌核病毒素草酸(OA)對(duì)油菜的誘導(dǎo)抗性表型及H2O2含量，然后以這些處理及菌核病接種處理為材料，構(gòu)建cDNA文庫(kù)，進(jìn)行較大規(guī)模的ESTs測(cè)序，并從歸并的Unique ESTs數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇已知的病害防御反應(yīng)途徑標(biāo)記(marker)基因，進(jìn)行表達(dá)分析，在此基礎(chǔ)上，以擬南芥防御信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)為依據(jù)，首次推導(dǎo)構(gòu)建了油菜對(duì)菌核病的防御反應(yīng)分子網(wǎng)絡(luò)，最后

3、以產(chǎn)H2O2的草酸氧化酶和葡萄糖氧化酶轉(zhuǎn)基因?yàn)椴牧涎芯框?yàn)證了H2O2在防御反應(yīng)或抗病反應(yīng)中的作用。
　　 BTH、MeJA和OA誘導(dǎo)處理油菜的抗病調(diào)查結(jié)果顯示，在一定濃度范圍內(nèi)這三種化學(xué)物質(zhì)都誘導(dǎo)了油菜對(duì)菌核病的抗性。Trypan blue染色結(jié)果顯示，菌絲在化學(xué)物質(zhì)處理葉片中的生長(zhǎng)都受到了抑制：DAB染色結(jié)果表明，化學(xué)物質(zhì)處理提高了H2O2的含量。這些結(jié)果預(yù)示著BTH、MeJA和OA能誘導(dǎo)油菜產(chǎn)生對(duì)菌核病的抗性，H2O2在抗病

4、反應(yīng)中起著重要作用。
　　 防御信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的標(biāo)記基因，如PDF1.2(茉莉酸途徑中的標(biāo)記基因)、PR-1(水楊酸途徑中的標(biāo)記基因)、NPR1(上述途徑調(diào)控基因)、APX(與氧爆發(fā)途徑相關(guān)的基因)以及PR-5、GLU和CHI等幾個(gè)病程相關(guān)蛋白基因在化學(xué)物質(zhì)及接菌處理油菜中的時(shí)序表達(dá)結(jié)果顯示，化學(xué)處理和病原接菌都能誘導(dǎo)這些基因的上調(diào)表達(dá)，這些基因在核盤菌接菌油菜中的表達(dá)規(guī)律與草酸處理中相似，這些結(jié)果表明油菜抗菌核病的分子機(jī)制與三

5、條防御信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)，抗病反應(yīng)可以通過H2O2誘發(fā)氧爆發(fā)途徑，進(jìn)而激活茉莉酸途徑和水楊酸途徑來實(shí)現(xiàn)。
　　 為系統(tǒng)研究油菜抗菌核病分子機(jī)制，本研究以MeJA、BTH、OA及S.sclerotiorum誘導(dǎo)處理油菜為材料構(gòu)建了cDNA文庫(kù)，并對(duì)文庫(kù)中9053個(gè)Unique ESTs進(jìn)行分析。大量的抗病基因(R-gene)類似物、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶和細(xì)胞壁相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)，預(yù)示著這些基因在油菜抗菌核病反應(yīng)中起著重要調(diào)控作用。找到62

6、0個(gè)防御反應(yīng)相關(guān)的基因，他們可能在油菜抗菌核病反應(yīng)中起著重要作用。發(fā)現(xiàn)了一些擬南芥防御反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)控基因，如EDS1、NDR1、EIN2和JAR1等，表明油菜中含有和擬南芥中相類似的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。據(jù)防御基因的表達(dá)結(jié)果及UniqueESTs數(shù)據(jù)庫(kù)的分析推測(cè)了油菜抗菌核病的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。
　　 為了證明H2O2在抗病反應(yīng)中的作用作用，對(duì)產(chǎn)H2O2的兩種酶，草酸氧化酶(OXO)和葡萄糖氧化酶(GO)的轉(zhuǎn)基因油菜進(jìn)行了抗菌核病