人臍帶間充質(zhì)干細胞的免疫調(diào)節(jié)能力的標準化與量化研究.pdf

1、第一部分標準化的無血清培養(yǎng)對人臍帶來源間充質(zhì)干細胞免疫調(diào)節(jié)活性的影響
　　臍帶來源間充質(zhì)干細胞(human Umbilical Cord Mensenchymal StemCell, hUC-MSCs)具有更強更穩(wěn)定的增殖分化能力，來源方便充足，對供者無傷害，病原微生物感染率低，安全性高。hUC-MSCs具有較高的免疫調(diào)控能力，是臨床治療血液疾病安全性高的異體干細胞。目前，傳統(tǒng)的MSCs培養(yǎng)體系中含有一定比例的動物血清(Serum

2、 Containing Medium)成分，對間充質(zhì)干細胞的臨床應用造成安全隱患。
　　本研究對比無血清與有血清培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs增殖、衰老、細胞表面及全能標志物、多向分化潛能，重點關(guān)注了兩個培養(yǎng)體系在免疫抑制方面的不同，探索培養(yǎng)hUC-MSCs的標準化方法，達到臨床的應用標準。
　　目的:驗證不同個體臍帶來源間充質(zhì)干細胞在無血清培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的安全性以及免疫調(diào)節(jié)作用，安全的應用于臨床治療。
　　方法:(1

3、)比較hUC-MSCs在有血清與無血清培養(yǎng)體系體外長期傳代以及衰老情況，測定生長曲線;長期傳代至終末期，采用Cellular Sencence Assay Kit檢測衰老相關(guān)的β半乳糖苷酶的活性;(2)流式檢測hUC-MSCs在有血清與無血清培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)其細胞表面分子標志以及全能標志物的檢測;(3)對比hUC-MSCs在有血清與無血清培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)其多向分化能力情況;(4)通過健康成人外周血激活期和靜止期的NK細胞分別與不同個體不

4、同培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs共培養(yǎng)，流式檢測IFN-γ陽性的NK細胞的百分比，評價對固有免疫的調(diào)節(jié)作用;(5)通過BrdU酶聯(lián)免疫吸附法對比兩個培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs對PBMC增值的抑制能力;(6)比較hUC-MSCs在有血清與無血清培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)后免疫抑制能力，通過不同個體不同培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs和健康成人外周血單個核細胞共培養(yǎng)，利用免疫酶聯(lián)試劑盒檢測上清中IFN-γ的分泌水平，檢測上清中PGE2、IDO、IL

5、-6的分泌，Real-time PCR檢測免疫相關(guān)因子TNF-beta、IL-10、IL-27、Galectin-1、Galectin-3、IDO1、COX2、 HGF及IL-6等mRNA的表達水平。
　　結(jié)果:(1)無血清培養(yǎng)的hUC-MSCs呈典型的長梭形貼壁細胞，與有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs相比生長曲線較平緩，對數(shù)生長較晚，較早出現(xiàn)β半乳糖苷酶的活性;(2)無血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs均高表達CD29，CD44

6、，CD73，CD90，CD105及CD106等間充質(zhì)干細胞的表面標記，不表達CD34，CD45，CD11b，CD19，HLA-DR，但是無血清培養(yǎng)的hUC-MSCs全能標志物Nanog，SOX2，Oct4，SSEA-4的陽性率更高;(3)無血清培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs與有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs均具有成脂成骨成軟骨分化能力;(4)兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs分別與激活期靜止期的NK細胞共培養(yǎng)16h后，流式檢測分泌IFN-γ

7、的NK細胞百分比均明顯減少，兩者沒有明顯差異，均對靜止期NK細胞的抑制能力更強;(5)無血清和有血清培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs均抑制外周血單個核細胞的增殖，均明顯抑制單個核細胞的IFN-γ分泌，兩者PGE2、IDO、IL-6的分泌均沒有差異，無血清培養(yǎng)體系分泌的HGF明顯高于有血清培養(yǎng)體系;(6) mRNA水平上無血清培養(yǎng)的hUC-MSCs表達的免疫相關(guān)因子TGF-beta1、IL-6、HGF高于有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs表達的，

8、但Galectin-1表達水平低于有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs表達的。
　　結(jié)論:(1)與傳統(tǒng)的有血清培養(yǎng)體系相比較，無血清培養(yǎng)體系體外增殖速度較慢、較早出現(xiàn)衰老;(2)無血清培養(yǎng)和有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs在細胞表面以及多向分化等生物學特性相似，無血清培養(yǎng)的hUC-MSCs具有更原始的狀態(tài);(3)無血清培養(yǎng)和有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs均具有較強的免疫調(diào)節(jié)能力，且沒有差異性。
　　第二部分:定量評估不同個體人臍帶間充質(zhì)干

9、細胞的免疫調(diào)節(jié)能力
　　間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細胞，在特定條件下分化為神經(jīng)細胞、成骨細胞等多種組織系統(tǒng)的細胞。此外，在造血、免疫、炎癥反應、血管新生等人體重要功能中起調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)在更多關(guān)注MSCs的低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)能力。臍帶間充質(zhì)干細胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC-M

10、SCs）分離自臍帶，涉及倫理問題較少相對更原始。MSC免疫抑制能力的最好例子是同種異體的MSC能有效治療重度移植物抗宿主病。體外研究表明，MSC能夠抑制T細胞免疫反應。目前對MSC免疫調(diào)節(jié)機制還不完全清楚，但是越來越多研究表明其主要通過細胞間接觸如PD1-PD-L1，及可溶性因子如前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、吲哚胺2，3-雙加氧酶(indoleamine2，3-dioxygenase，IDO)、半乳糖凝集

11、素-1(Galectin-1，Gal-1)、半乳糖凝集素-3(Galectin-3，Gal-3)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforminggrowth factor-beta，TGF-β)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)等發(fā)揮免疫抑制功能。hUC-MSC治療自身免疫系統(tǒng)疾病、移植物抗宿主病已經(jīng)由實驗研究階段進入臨床試驗階段，多項臨床試驗證實hUC-MSC有很好的應用前景，但不同個體臍帶來源

12、間充質(zhì)干細胞免疫活性差別很大，目前缺乏統(tǒng)一的標準方法篩選出強免疫調(diào)節(jié)能力的理想細胞。
　　目的:驗證不同個體臍帶間充質(zhì)干細胞免疫抑制能力具有穩(wěn)定的差異性，以人外周血單個核共培養(yǎng)體系作為檢測細胞生物學效力的方法不穩(wěn)定因素太多，所以我們需探尋定量檢測臍帶間充質(zhì)干細胞免疫活性的方法，為臨床治療打下基礎(chǔ)。
　　方法:(1)不同個體hUC-MSC和健康成人外周血單個核細胞體外共培養(yǎng)，免疫酶聯(lián)試劑盒檢測上清IFN-γ的分泌水平，反應人臍

13、帶間充質(zhì)干細胞對活化后的外周血單個核細胞免疫抑制能力;(2)外源性炎癥因子刺激不同個體hUC-MSC在mRNA水平上免疫相關(guān)因子的表達;（3)外源性炎癥因子刺激不同個體hUC-MSC，培養(yǎng)24小時后收集上清。酶聯(lián)免疫吸附法檢測間充質(zhì)干細胞PGE2、IDO、Galectin-I、Galectin-3、TGF-beta1、HGF的分泌，驗證蛋白分泌與免疫抑制能力的相關(guān)性;(4)吲哚胺2，3-二氧化酶(IDO)特異性抑制劑1-M-Trp、前列

14、腺素E2(PGE2)合成抑制劑NS-398預處理，分別阻斷hUC-MSCs分泌PGE2、IDO，和健康成人外周血單個核細胞共培養(yǎng)，檢測阻斷蛋白分泌后對hUC-MSCs免疫抑制效應的影響。
　　結(jié)果:(1)不同個體hUC-MSCs對IFN-γ分泌的抑制能力有顯著性差異性穩(wěn)定存在，對IFN-γ分泌的抑制率可反映個體hUC-MSC的免疫抑制能力;(2)炎癥因子刺激后IDO1、COX2、 TGF-beta1、Galectin-1、HGF、

15、IL-6、Galectin-3等免疫相關(guān)因子mRNA明顯升高，IL-10、IL-27未見明顯變化。(3)比較不同個體hUC-MSC刺激后的因子分泌量與其抑制IFN分泌的抑制率的相關(guān)性，得出結(jié)論PGE2具最高的相關(guān)性，IDO、IL-6次之。(4)阻斷IDO未逆轉(zhuǎn)hUC-MSC對于活化單個核細胞IFN-γ抑制作用，但阻斷PGE2后，hUC-MSC對活化單個核細胞IFN-γ抑制作用顯著降低，盡管未完全逆轉(zhuǎn)，但說明了PGE2的關(guān)鍵性作用。