CopC穩(wěn)定性研究.pdf

1、CopC是革蘭氏陰性菌抗銅操縱子cop所編碼的四個蛋白之一，其存在于高氧化細(xì)胞周質(zhì)空間內(nèi)，與其他抗銅蛋白(膜結(jié)合蛋白CopB、CopD和細(xì)胞周質(zhì)蛋白CopA)在CopR，CopS調(diào)控基因參與下，共同調(diào)控革蘭氏陰性菌體內(nèi)銅平衡。apoCopC在溶液狀態(tài)下，呈現(xiàn)由9股β折疊通過“l(fā)oop”結(jié)構(gòu)相連形成希臘拓?fù)洇?sandwich結(jié)構(gòu)。CopC含有102個氨基酸殘基，僅有一個的色氨酸和酪氨酸殘基分別位于83位和79位。
　　為探究83位

2、色氨酸殘基和79位酪氨酸殘基在維系蛋白質(zhì)穩(wěn)定性中發(fā)揮的作用，本文用定點突變的方法構(gòu)建得到四個酪氨酸或色氨酸突變體(Y79W, Y79F,Y79W-W83F和Y79W-W83L)。通過DNA序列分析鑒定所得突變體為目的基因。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21細(xì)胞中，在誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)下實現(xiàn)蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)。經(jīng)陰、陽離子交換層析柱純化后獲得純度較高的目的蛋白，并經(jīng)SDS-PAGE、質(zhì)譜、紫外可見吸收光譜、遠(yuǎn)紫外CD譜等多種方法證實。
　

3、　針對文獻(xiàn)報道的蛋白三態(tài)解折疊自由能計算方法所存在的問題（用該方法計算的三態(tài)解折疊蛋白去折疊自由能不能與兩態(tài)解折疊蛋白的比較），本文提出一個新方法。該方法是在經(jīng)典假設(shè)（蛋白三態(tài)解折疊過程可看作是兩獨立的兩態(tài)去折疊過程的疊加）基礎(chǔ)上，引入摩爾分布分?jǐn)?shù)，將蛋白三態(tài)解折疊過程看作是兩個兩態(tài)解折疊以一定的摩爾分?jǐn)?shù)組合而成。蛋白總?cè)フ郫B自由能是由這兩個兩態(tài)去折疊自由能以摩爾分?jǐn)?shù)相加得到。通過對α-亞基色氨酸合成酶變性數(shù)據(jù)分析和本文CopC變性體系

4、研究發(fā)現(xiàn)，該新方法具有普遍適用性，且應(yīng)用該新方法計算所得去折疊自由能較文獻(xiàn)報道方法更為精確、合理。
　　apoCopC特殊的疏水桶狀結(jié)構(gòu)，使其具有潛在的超分子性質(zhì)。apoCopC與Vitamin B6相互作用研究顯示，Vitamin B6可以進入蛋白質(zhì)疏水桶內(nèi)，與其形成5∶1穩(wěn)定超分子包合物。對二者在不同離子強度溶液中的相互作用研究和分子模擬計算發(fā)現(xiàn)二者之間主要通過形成氫鍵結(jié)合。蛋白質(zhì)與Vitamin B6結(jié)合前后熱穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)

5、小分子結(jié)合不會造成蛋白質(zhì)構(gòu)象較大變化，也不會影響蛋白質(zhì)耐熱穩(wěn)定性。
　　對apoCopC及其突變體蛋白熒光性質(zhì)（熒光光譜、熒光壽命和熒光猝滅）研究，發(fā)現(xiàn)CopC蛋白中83位附近微環(huán)境極其疏水，而79位附近微環(huán)境與83位的相比則較為親水;突變蛋白Y79W中位于83位和79位的色氨酸殘基均對蛋白質(zhì)熒光有貢獻(xiàn)。通過遠(yuǎn)紫外CD譜和脲變性、鹽酸胍變性、熱變性等實驗方法研究CopC中Tyr79在維系蛋白質(zhì)穩(wěn)定性中的重要作用。研究發(fā)現(xiàn)Tyr79

6、與其他氨基酸殘基間的氫鍵作用，參與蛋白質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)的形成;而其通過芳環(huán)與其他氨基酸殘基間的疏水作用或芳環(huán)堆積作用對穩(wěn)定蛋白亦十分重要。對Y79W、Y79W-W83F和Y79W-W83L的穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)CopC中位于83位的色氨酸殘基的芳香環(huán)與其他氨基酸殘基間的相互作用在穩(wěn)定蛋白質(zhì)核心結(jié)構(gòu)（疏水桶）中起重要作用。
　　apoCopC具有兩個金屬離子結(jié)合位點，分別位于蛋白相距約30(A)的兩端(C-端和N-端)，可以高親和結(jié)合Cu+和C

7、u2+。本文研究了apoCopC及其突變蛋白與金屬離子的結(jié)合性質(zhì)，最終著眼于金屬離子結(jié)合對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響。apoCopC可以高效、專一結(jié)合Cu2+，由于與Cu2+配位的氨基酸殘基在空間結(jié)構(gòu)上相距較近，突變后并不干擾蛋白Cu2+結(jié)合部位構(gòu)象，因此也不會對其Cu2+結(jié)合性質(zhì)造成影響;Cu2+結(jié)合后會使apoCopC及其突變蛋白穩(wěn)定性增大，其可能的機理為Cu2+結(jié)合后會造成蛋白質(zhì)構(gòu)象重排，使蛋白局部結(jié)構(gòu)更加緊致;結(jié)合Cu2+后，(M-)C

8、opC的解折疊行為由兩態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槿龖B(tài)為這一構(gòu)象重排假說提供了證據(jù);而對Y79W-W83F和Y79W-W83F-Cu2+變性過程中物種分布比較，發(fā)現(xiàn)CopC在變性過程中優(yōu)先變性蛋白質(zhì)C-端結(jié)構(gòu)，即蛋白N-端結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。同時，我們發(fā)現(xiàn)(M-)CopC中C-端金屬離子結(jié)合部位可與Ag+結(jié)合，且該金屬離子結(jié)合位點的占據(jù)并未造成(M-)CopC蛋白質(zhì)穩(wěn)定性明顯改變，可見CopC中N-端結(jié)構(gòu)在維持蛋白穩(wěn)定性中起主導(dǎo)作用。apoCopC與Hg2+的相