γ-PGA酸水解測(cè)定法的改進(jìn)及發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA過(guò)程分子量分布和水解酶基因克隆的研究.pdf

1、γ-PGA(γ-聚谷氨酸)是一種有極大開(kāi)發(fā)價(jià)值和前景的多功能性生物制品,近年來(lái)被作為增稠劑,保濕劑,藥物載體等而一直被廣泛應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域。它是一種水溶性和可生物降解的新型生物高分子材料,是一種通過(guò)微生物合成,由谷氨酸單體以γ-羧基與氨基相縮合而成的均聚氨基酸化合物。
　　 以實(shí)驗(yàn)室從納豆中自行分離出來(lái)的γ-聚谷氨酸(γ-PGA)高產(chǎn)菌株Bacillus subtilis ZJUTZY為研究對(duì)象,進(jìn)行了Bacillus subti

2、lis ZJUTZY發(fā)酵產(chǎn)物γ-PGA檢測(cè)方法的修正；考察了培養(yǎng)時(shí)間和不同碳源對(duì)γ-PGA產(chǎn)量以及其分子量分布變化情況；最后考察了Bacillus subtilisZJUTZY對(duì)γ-PGA的降解,并進(jìn)行了水解酶基因ywtD的克隆。
　　 測(cè)定γ-PGA最常利用的方法是酸水解法,但酸水解法測(cè)定γ-PGA周期長(zhǎng)且步驟多,本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)醇沉過(guò)程和水解液的pH中和步驟會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果錯(cuò)誤。本論文通過(guò)增測(cè)醇沉物水溶指標(biāo),消除了醇沉步驟中谷氨酸

3、晶體沉淀析出帶來(lái)的影響；通過(guò)控制水解液中和步驟中NaOH的添加量,減小了γ-PGA的水解定量檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)誤差。另外通過(guò)比較生物傳感儀SBA與高效液相色譜測(cè)得的γ-PGA產(chǎn)量數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)Bacillus subtilis ZJUTZY合成的γ-PGA主要是由L-谷氨酸組成的,因此可以利用生物傳感儀(酶電極只測(cè)L-谷氨酸)來(lái)代替HPLC測(cè)定γ-PGA產(chǎn)量。
　　 然后利用SBA檢測(cè)了Bacillus subtilis ZJUTZY發(fā)

4、酵產(chǎn)γ-PGA過(guò)程曲線,發(fā)現(xiàn)Bacillus subtilis ZJUTZY發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的產(chǎn)量在30 h開(kāi)始出現(xiàn)下降。同時(shí)用SDS-PAGE考察了分子量分布的變化情況,分子量分布也有相應(yīng)變化,具體原因有待考察；檢測(cè)了不同碳源對(duì)Bacillussubtilis ZJUTZY發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA產(chǎn)量以及分子量分布的影響,發(fā)現(xiàn)碳源對(duì)γ-PGA產(chǎn)量和γ-PGA分子量分布均有影響。
　　 針對(duì)Bacillus subtilis ZJUTZ

5、Y發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA過(guò)程曲線中30 h后出現(xiàn)的產(chǎn)量下降現(xiàn)象,考察了Bacillus subtilis ZJUTZY在γ-PGA為唯一營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)和對(duì)γ-PGA的水解作用,發(fā)現(xiàn)其確實(shí)存在水解功能。
　　 根據(jù)文獻(xiàn)和Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的γ-PGA水解酶基因報(bào)道,Bacillus subtilis ZJUTZY的γ-PGA水解酶核心基因很可能為ywtD,據(jù)此,設(shè)計(jì)了1組正反向引物ywtD-F和ywtD—R,以Baci

6、llus subtilisZJUTZY基因組DNA為模板時(shí),PCR獲得了一段長(zhǎng)1376bp的基因片段,對(duì)PCR片段進(jìn)行序列測(cè)定,發(fā)現(xiàn)該基因片段與多種Bacillus subtilis菌株的ywtD基因具有較高的同源性,相似度達(dá)到了99％,故可初步認(rèn)定PCR得到的DNA片段為ywtD基因的目標(biāo)序列。結(jié)果表明Bacillussubtilis ZJUTZY確實(shí)有水解酶基因,水解酶可能就是Bacillus subtilisZJUTZY發(fā)酵產(chǎn)γ-