動態(tài)力學(xué)刺激對構(gòu)建取向性絲素蛋白組織工程纖維環(huán)的影響.pdf

1、目的：
　　1.以絲素蛋白溶液為原料，采用濕仿法技術(shù)，制備環(huán)形取向性絲素蛋白（SF）組織工程纖維環(huán)支架，并評估其理化性能。
　　2.分離培養(yǎng)兔纖維環(huán)細(xì)胞，接種到該絲素蛋白纖維環(huán)支架，體外構(gòu)建組織工程纖維環(huán)并評估其理化性能。
　　3.利用自行研制的生物反應(yīng)器研究力學(xué)刺激對體外構(gòu)建組織工程纖維環(huán)的影響。
　　方法：
　　1.以絲素蛋白溶液為原料，采用濕仿法制備環(huán)形取向性 SF組織工程纖維環(huán)支架。采用體視顯微鏡、

2、掃描電鏡(SEM)觀察支架觀察支架表面形態(tài)、纖維直徑。測定支架的孔徑、孔隙率、吸水率。微材料力學(xué)性能測試機(jī)測定支架壓縮彈性模量。
　　2.分離培養(yǎng)兔纖維環(huán)(AF)細(xì)胞并接種至 SF支架上，體外培養(yǎng)一段時間。通過體視顯微鏡觀察細(xì)胞-支架復(fù)合物的大體形態(tài)，SEM、Live/dead染色觀察細(xì)胞在支架上的黏附、活性和增殖情況。組織工程纖維環(huán)分別于體外培養(yǎng)3、7、14天行組織學(xué)染色觀察，并行總DNA定量分析及蛋白多糖、膠原生化定量分析，同

3、時檢測其力學(xué)性能的變化。
　　3.利用自行研制的循環(huán)灌流力學(xué)加載儀對培養(yǎng)的組織工程纖維環(huán)進(jìn)行壓縮力學(xué)刺激。頻率1Hz，壓縮幅度分別為組織工程纖維環(huán)高度的5％、10%、15%、20%。刺激時間分別為3、7、14天，2小時/天。固定后行組織學(xué)切片染色觀察，并對總DNA、蛋白多糖和Ⅰ、Ⅱ行膠原進(jìn)行定量分析，檢測不同組之間壓縮彈性模量及組織工程椎間盤高度的變化。
　　結(jié)果：
　　1.體式顯微鏡和掃描電鏡示支架呈乳白色，中空環(huán)形

4、，內(nèi)徑4㎜，外徑8㎜，高2㎜。SF纖維排列呈條帶狀、環(huán)形平行取向，纖維表面光滑，均一性好。纖維直徑(51.06±9.65)μm，孔隙率(60.37±0.08)%。
　　2.體視顯微鏡可見細(xì)胞支架復(fù)合物顏色隨時間延長而加深。SEM示細(xì)胞粘附在支架上，且分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)。細(xì)胞及胞外基質(zhì)隨時間增多。Live/dead染色示細(xì)胞活性良好，在絲上及孔隙中大量增殖。組織學(xué)染色顯示細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)均沿微米纖維取向性分布，且染色陽性強(qiáng)隨時間增強(qiáng)

5、；總DNA定量，蛋白多糖、Ⅰ、Ⅱ型膠原生化定量檢測顯示細(xì)胞增殖明顯，細(xì)胞外基質(zhì)分泌逐漸增加（P<0.05）。壓縮模量隨培養(yǎng)時間增加而逐漸增加。
　　3.體視顯微鏡可見不同型變量組支架細(xì)胞復(fù)合物顏色均隨時間顏色加深，刺激14天后5%、10%、15%形變量顏色最深。組織學(xué)HE染色可見不同型變量組細(xì)胞及其分泌物均隨時間而增值，刺激14天后可見5%、10%、15%形變量組細(xì)胞較多。甲苯胺藍(lán)、番紅O染色可見GAG分泌隨著時間增加而增多，刺激

6、14天后可見5%、10%、15%形變量組明顯有GAG聚集。Ⅰ、Ⅱ型膠原染色可見膠原分泌隨時間增加而增多，刺激14天后可見5%、10%形變量組有明顯的膠原聚集。Ⅰ、Ⅱ型膠原定量檢測證明刺激14天后10%形變量組分泌最多。GAG定量證明15%形變量組分泌膠原最多，但是10%形變量組與15%形變量組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？侱NA定量分析可見5%形變量組DNA最高。壓縮彈性模量顯示20%形變量組最大，但是15%組與其沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。力學(xué)加載后組織工程

7、椎間盤高度變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　1.采用濕仿法構(gòu)建環(huán)形取向性SF纖維環(huán)支架，孔徑、孔隙率適宜，細(xì)胞相容性良好，力學(xué)性能優(yōu)越，是較為理想的組織工程椎間盤支架。
　　2.纖維環(huán)支架復(fù)合兔AF細(xì)胞體外培養(yǎng)一段時間后，能夠構(gòu)建出在結(jié)構(gòu)、理化性能上模擬天然纖維環(huán)組織的組織工程纖維環(huán)；絲素蛋白纖維環(huán)支架的生物相容性良好。
　　3.力學(xué)環(huán)境與纖維環(huán)細(xì)胞在支架上的增值和分泌關(guān)系密切，適宜的力學(xué)刺激是纖維環(huán)細(xì)胞增殖