非諾貝特干預(yù)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)組織自噬及氧化應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy，DR)是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，是成年人致盲的主要原因之一。目前發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。近年研究表明DR的視網(wǎng)膜神經(jīng)元改變早于微血管改變。而對于非諾貝特在DR早期中的對視網(wǎng)膜神經(jīng)元的自噬改變和氧化應(yīng)激作用研究較少。
　　目的：自噬和活性氧（reactive oxygen species，ROS）是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的雙重防御機(jī)制，在某些病理情況下具有“雙刃劍”的效應(yīng)。自噬以及 NA

2、DPH氧化酶（NOX）在DR中的作用報道較少，后者可能是以高調(diào)控方式產(chǎn)生ROS的氧化酶體。本實(shí)驗(yàn)在鏈脲菌素（streptozotocin，STZ）大鼠動物模型中，通過觀察非諾貝特干預(yù)后早期視網(wǎng)膜神經(jīng)組織自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)和NOX源性ROS的變化影響，對非諾貝特能否調(diào)節(jié)自噬、減少氧化應(yīng)激損傷延緩DR病程做初步探討。
　　方法：
　　1、58只SD雄性大鼠，隨機(jī)分成Control組（n=16），STZ組（n=21），F(xiàn)eno+S

3、TZ組（n=21）；腹腔注射STZ，成功建立STZ誘導(dǎo)I型糖尿病大鼠模型。分別在不同時間點(diǎn)，處死大鼠，取出大鼠視網(wǎng)膜。
　　2、大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)檢測：眼球常規(guī)石蠟切片，HE染色行組織病理學(xué)檢查，觀察視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)組織改變。
　　3、檢測大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元NOX氧化酶表達(dá)和ROS生成量變化：DHE染色檢測三組大鼠視網(wǎng)膜建模4、8周時ROS生成量的變化；免疫組化檢測NADPH氧化酶亞基gp91phox，P47phox蛋白在三組

4、大鼠4周和8周時視網(wǎng)膜的表達(dá)變化。
　　4、檢測大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元4周、8周時自噬相關(guān)蛋白的改變：Westernblott檢測LC3、Atg5在視網(wǎng)膜的表達(dá)變化；免疫組化染色檢測LC3蛋白的表達(dá)變化；電鏡下觀察糖尿病大鼠不同時間點(diǎn)視網(wǎng)膜自噬體的變化。
　　5、TUNEL熒光染色觀察三組大鼠4周、8周時視網(wǎng)膜各層細(xì)胞有無凋亡。
　　結(jié)果:
　　1、STZ腹腔注射，成功建立I型糖尿病大鼠模型。
　　2、視網(wǎng)膜組織

5、病理學(xué)改變：Control組大鼠視網(wǎng)膜組織切片HE染色可見各層細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常。STZ組4周,8周時可見節(jié)細(xì)胞輕度減少，視網(wǎng)膜厚度無明顯改變；8周時 STZ組可見內(nèi)核層外核層細(xì)胞減少，排列紊亂，細(xì)胞間距增大；而Feno+STZ組與同期對照組相比未見明顯變化。
　　3、STZ和Feno+STZ兩組大鼠視網(wǎng)膜組織ROS生成量4周、8周時都增加，免疫組化gp91phox、p47phox蛋白主要在節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)、外核層，視網(wǎng)膜色素

6、上皮層表達(dá)，且表達(dá)調(diào)高，但Feno+STZ組的各項(xiàng)指標(biāo)均較STZ組表達(dá)稍低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4、免疫組化和Westernblott檢測：LC3蛋白在視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層、外核層有表達(dá)，4周和8周時STZ組和Feno+STZ組表達(dá)較對照組明顯增加；Westernblott檢測：Atg5蛋白在4周時3組表達(dá)與LC3一致，而在8周時，Atg5表達(dá)在STZ組和Feno+STZ組均低于對照組。
　　4、電鏡下觀察：2周時即可發(fā)現(xiàn)STZ組

7、和Feno+STZ組視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層、外核層出現(xiàn)自噬體和局部線粒體空泡樣變化，且Feno+STZ組略多。建模早期，電鏡技術(shù)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層即可觀察到自噬體增加和線粒體腫脹，并隨時間增加；提示細(xì)胞自噬異常可能是糖尿病病理的直接結(jié)果，而不是后來廣泛血管疾病的結(jié)果。
　　5、建模4周的STZ組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層出現(xiàn)零星細(xì)胞凋亡；建模8周，STZ組大鼠視網(wǎng)膜可見少量細(xì)胞凋亡。而同期Control組、Feno+STZ組均未見明顯凋亡細(xì)

8、胞，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1、糖尿病大鼠早期視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列松散，形態(tài)學(xué)輕度改變；Feno+STZ組視網(wǎng)膜表現(xiàn)與同期對照組相同。
　　2、糖尿病大鼠視網(wǎng)膜ROS產(chǎn)生增加，NADPH氧化酶表達(dá)增加；非諾貝特能緩解視網(wǎng)膜神經(jīng)組織NOX活性以及NOX源性ROS的含量。
　　3、糖尿病大鼠早期出現(xiàn)視網(wǎng)膜內(nèi)層細(xì)胞自噬異常，自噬相關(guān)蛋白表達(dá)出現(xiàn)變化；非諾貝特增強(qiáng)了視網(wǎng)膜內(nèi)層細(xì)胞的自噬過程。
　　4、4周