利用原始卵泡體外重構(gòu)模型對小鼠原始卵泡形成機制的研究.pdf

1、原始卵泡的形成涉及復(fù)雜的生殖細胞-體細胞互作，本實驗利用原始卵泡重構(gòu)模型，研究了決定小鼠原始卵泡形成的重要因素及其作用的調(diào)控機制，結(jié)果表明： 經(jīng)酶解離的小鼠胚胎卵巢細胞經(jīng)體外培養(yǎng)可以重構(gòu)形成原始卵泡。通過組織學(xué)及基因表達的分析，可以確定體外重構(gòu)形成的原始卵泡具有典型的原始卵泡結(jié)構(gòu)。正常的原始卵泡相關(guān)基因(Zp1-3，F(xiàn)iga，Cx43)的表達以及正常的原始卵泡發(fā)育能力，原始卵泡啟動發(fā)育所必須的調(diào)控因子Gdf9，Bmp15和Fsh

2、r基因的表達都可以在體外培養(yǎng)的重構(gòu)卵泡中檢測到。 從13.5dpc起，胎鼠卵巢細胞開始具有體外重構(gòu)形成原始卵泡的能力。12.5dpc胎鼠卵巢的生殖細胞可以在體外培養(yǎng)中發(fā)育為卵母細胞，但不能與此時的卵巢體細胞互作形成原始卵泡。通過對比原始卵泡相關(guān)基因在體外培養(yǎng)的13.5dpc和12.5dpc胎鼠卵巢細胞中的差異表達，得出Zp基因的正常表達決定卵母細胞在發(fā)育早期的分化，F(xiàn)iga基因的持續(xù)表達是決定原始卵泡能夠在體外重構(gòu)的必須因素。

3、 利用上述胎鼠生殖細胞與體細胞之間細胞聯(lián)系的分離和重構(gòu)模型，我們隨后研究了在體外重構(gòu)形成轉(zhuǎn)基因卵泡的可能性。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是研究基因功能的強有力的手段。然而對于卵母細胞而言，細胞分裂的特殊性和卵泡結(jié)構(gòu)決定了到目前為止仍不能夠?qū)⑼庠椿驅(qū)氚l(fā)育中的卵母細胞。本實驗中，我們研究了將外源基因?qū)胩ナ舐殉采臣毎姆椒翱尚行浴＿x擇從11.5dpc到15.5dpc，處于不同細胞分裂狀態(tài)的胎鼠卵巢生殖細胞用于轉(zhuǎn)染實驗。研究發(fā)現(xiàn)，通常的傳染方法：

4、磷酸鈣法和脂質(zhì)體法均可以用于胎鼠卵巢生殖細胞的轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體法擁有較高的轉(zhuǎn)染效率并且對細胞沒有明顯的傷害，但是在適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染液孵育時間內(nèi)(3h)，雖然磷酸鈣方法的轉(zhuǎn)染效率較低，但其對細胞后續(xù)的發(fā)育能力保護更好一些。從13.5dpc起，當(dāng)胎鼠卵巢生殖細胞開始進入減數(shù)分裂時，全部的胎鼠卵巢生殖細胞便失去整合外源基因的能力。在15.5dpc之前，尤其是在11.5～13.5dpc，外源基因在胎鼠卵巢生殖細胞中可表達，為在卵子發(fā)生早期階段進行基因功能

5、的研究提供了新的實驗手段。 基于原始卵泡體外重構(gòu)模型和卵原細胞轉(zhuǎn)基因方法，我們進一步研究了在體外原始卵泡形成的過程中，生殖細胞與體細胞互作的機制。利用一系列的胎鼠卵巢細胞共培養(yǎng)，以及“互換、互作卵泡重構(gòu)”實驗。我們發(fā)現(xiàn)，原始卵泡形成的過程要求高度同步發(fā)育的生殖細胞—體細胞互作。同樣具備卵泡重構(gòu)能力的、不同胎齡的胎鼠卵巢生殖細胞和體細胞在體外互換、互作之后，正常的原始卵泡形成過程不能完成。在培養(yǎng)過程中，生殖細胞Figa基因的表達逐

6、漸缺失，原始卵泡形成過程不能正常地進行，伴隨著Bax基因的異常表達，生殖細胞將發(fā)生退化死亡。 原始卵泡形成時生殖細胞將發(fā)生大量的凋亡而體細胞則處于細胞分裂的抑制狀態(tài)。因此，基于上述胎鼠卵巢中細胞數(shù)量控制的現(xiàn)象可能對原始卵泡庫建立時卵泡的數(shù)量起調(diào)控作用的猜測，在本實驗中，利用原始卵泡重構(gòu)模型，我們研究了生殖細胞與體細胞的數(shù)量對重構(gòu)形成原始卵泡數(shù)量的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，增加生殖細胞或體細胞的數(shù)量，并不會促進重構(gòu)原始卵泡數(shù)量的增加，相反會

7、導(dǎo)致體細胞出現(xiàn)異常增殖生長，生殖細胞不能最終分化為健康的卵母細胞，進而最終導(dǎo)致正常的原始卵泡形成過程不能發(fā)生。由此可見，原始卵泡的形成過程存在精確控制的生殖細胞—體細胞數(shù)量的平衡，該平衡的破壞可導(dǎo)致原始卵泡形成的失敗。 由于前人和我們現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)Figa基因是形成原始卵泡的必須因素，于是通過原位雜交技術(shù)及Tunel凋亡檢測，我們研究了Figa基因在1dpp小鼠卵巢中的表達及其與原始卵泡形成時生殖細胞的選擇和生殖細胞凋亡的關(guān)系。

8、研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)iga基因在1dpp小鼠卵巢中的表達存在生殖細胞間的差異，即同時存在Figa基因表達的陽性和陰性生殖細胞，這種Figa基因在生殖細胞間的差異表達在原始卵泡形成前的17.5dpc胎鼠卵巢中即可以檢測到。Figa基因在1dpp小鼠卵巢生殖細胞間的差異表達可能與原始卵泡形成時卵母細胞的選擇有關(guān)。同時，由于凋亡的生殖細胞中也可以檢測Figa基因的表達，因此Figa基因在1dpp小鼠卵巢中的差異表達可能并不決定此時卵巢中的生殖細胞凋亡

9、。 中腎組織對胚胎卵巢分化和發(fā)育的作用目前尚未明確，而12.5dpc是胎鼠卵巢分化的關(guān)鍵時期。因此在本實驗中我們研究了12.5dpc的中腎組織對此時的胎鼠卵巢細胞體外分化發(fā)育的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中腎細胞并不能促進12.5dpc胎鼠卵巢細胞在體外培養(yǎng)中獲得體外重構(gòu)形成原始卵泡的能力。在無血清組織培養(yǎng)體系下，12.5dpc胎鼠卵巢自身可進行卵巢細胞的分化并形成原始卵泡。而在該培養(yǎng)條件下，中腎組織的存在會導(dǎo)致卵巢細胞的正常分化受到抑制，

10、這主要表現(xiàn)為體細胞未能完成前顆粒細胞的分化，卵母細胞未能形成原始卵泡并完成最終分化。即在12.5dpc胚胎小鼠中，中腎組織對卵巢的分化具有作用，其作用的方向可能依賴于某些未知的因子和激素的存在。 連接蛋白被認為對卵泡發(fā)育過程中的細胞間互作和信號傳遞具有重要的意義。在本實驗中，利用免疫組織化學(xué)技術(shù)，我們系統(tǒng)的研究了在小鼠胚胎卵巢發(fā)育過程中連接蛋白26(Cx26)的表達情況。研究發(fā)現(xiàn)，Cx26在胚胎卵巢發(fā)育的早期即可檢測到，并且在生

11、殖細胞之間存在差異表達。在大量卵泡形成啟動前(18.5dpc)Cx26在生殖細胞之間的差異表達可能與原始卵泡形成的啟動機制有關(guān)。而在原始卵泡形成時(1dpp)，Cx26在原始卵泡中生殖細胞的差異表達提示其可能并不參與原始卵泡形成時生殖細胞的選擇。Cx26在原始卵泡庫建立后直到性成熟卵巢中僅表達于卵母細胞和卵泡膜細胞的現(xiàn)象提示Cx26可能參與原始卵泡庫的最終建立。 綜上所述，本論文通過對原始卵泡形成時生殖細胞-體細胞間互作(發(fā)育階