靶向EGFRvIII并包裹液態(tài)氟碳高分子納米球的制備及其性質研究.pdf

1、目的：
　　制備以EGFRvIII為靶點，EGFRvIII的單抗4G1為靶向分子的靶向高分子納米超聲造影劑，并對其性質及體外靶向能力進行研究。
　　第一部分表皮生長因子受體突變體III（EGFRvIII）單抗4G1的特異性驗證
　　方法：
　　培養(yǎng)膠質瘤細胞F98EGFR（EGFR+/EGFRvIII-）和F98npEGFRvIII（EGFR-/EGFRvIII+），對細胞蛋白進行免疫印跡（WB）實驗以驗證抗體4

2、G1對EFGRvIII蛋白的特異性；對F98EGFR和F98npEGFRvIII細胞進行流式細胞術（FCM）和免疫熒光（IF）實驗以驗證抗體4G1與EFGRvIII陽性細胞的特異性結合；氯胺T法制備131I-4G1，以探究抗體4G1與細胞穩(wěn)定結合的最佳時間。
　　結果：
　　4G1與F98npEGFRvIII細胞蛋白結合出現(xiàn)免疫印跡條帶，而不與F98EGFR細胞蛋白結合出現(xiàn)免疫印跡條帶；4G1與F98npEGFRvIII細胞

3、的結合率為（90.84±0.56）%，與F98EGFR細胞的結合率僅為（2.90±0.07）%；熒光顯微鏡下，F(xiàn)98npEGFRvIII細胞的胞核呈藍色，細胞膜呈綠色熒光，F(xiàn)98EGFR僅有胞核呈藍色，細胞膜外無綠色熒光；氯胺 T法制備的13lI-4G1在30 min、60 min、120 min、240 min和480 min時與F98npEGFRvIII細胞的結合率分別為（39.45±0.06）%、（49.19±0.48）%、（69

4、.64±0.19）%、（59.19±0.63）%和（55.79±0.69）%，與F98EGFR細胞在各個時間點的結合率分別為（2.91±0.21）%、(2.97±0.75)%、(2.95±0.65)%、（2.96±0.43）%和（3.02±0.50）%。
　　結論：
　　單抗4G1僅能夠特異性地識別EGFRvIII陽性細胞蛋白，13lI-4G1僅與EGFRvIII陽性的F98npEGFRvIII細胞特異性結合，且在120 m

5、in時與F98npEGFRvIII細胞的結合率最高。
　　第二部分攜EGFRvIII抗體4G1的PLGA納米球的制備及其性質研究
　　方法：
　　采用雙乳化溶劑揮發(fā)法制備包裹液態(tài)氟碳的高分子納米球（P-NPs）；碳二亞胺法（EDC/NHS）偶聯(lián)P-NPs與4G1抗體，獲得靶向EGFRvIII的高分子納米球P-NPs-4G1；光鏡和掃描電鏡下觀察P-NPs-4G1的形態(tài)及分布特征；激光粒徑儀檢測P-NPs-4G1的粒徑及

6、Zeta電位；流式細胞術與激光共聚焦顯微鏡檢測P-NPs與4G1的偶聯(lián)情況；倒置熒光顯微鏡下觀察熱作用致P-NPs-4G1相變前后情況；超聲診斷儀檢測P-NPs-4G1在體外經(jīng)低強度聚焦超聲（LIFU）輻照致相變前后情況；流式細胞術和激光共聚焦顯微鏡檢測P-NPs-4G1在體外與腫瘤細胞的靶向結合情況；在裸鼠腫瘤模型上，檢測P-NPs-4G1在體內(nèi)的靶向超聲顯像情況。
　　結果：
　　所制備的P-NPs-4G1納米球外觀呈乳

7、懸液狀；光鏡下形態(tài)規(guī)則，呈球形；電鏡下呈球形或類球形，表面光滑，形態(tài)規(guī)則；粒徑儀測得P-NPs-4G1的平均粒徑為（563.8±60.3）nm，表面電位（-32.4±3.37）mV；P-NPs與4G1的連接率為（97.37±1.57）%；P-NPs-4G1體外經(jīng)熱作用后可發(fā)生明顯的液氣相轉變產(chǎn)生微氣泡；經(jīng)LIFU輻照后發(fā)生相變而產(chǎn)生微氣泡，超聲波診斷儀檢測超聲顯像效果增強；在體外靶向實驗中證實P-NPs-4G1可與EGFRvIII陽性的

8、F98npEGFRvⅢ（EGFR-/EGFRvIII+）細胞特異性結合，而不與EGFR陽性的F98EGFR（EGFR+/EGFRvIII-）細胞結合；在裸鼠腫瘤模型上，P-NPs-4G1經(jīng)尾靜脈注射、LIFU輻照后的體內(nèi)超聲顯像未得到理想的結果。
　　結論：
　　本研究成功制備出能夠特異性靶向EGFRvIII并包裹液態(tài)氟碳的高分子納米球P-NPs-4G1，其性質穩(wěn)定，在體外經(jīng)聲熱作用后可發(fā)生液氣相轉變，增強超聲顯像效果，在體