下丘腦室旁核CRH神經(jīng)元激活在慢性充血性心力衰竭中的交感興奮作用及機(jī)制研究.pdf

1、慢性充血性心力衰竭（簡稱慢性心衰）是多種心血管疾病的共同終末階段。多年來研究證實(shí)交感神經(jīng)活動增強(qiáng)是慢性心衰發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。交感神經(jīng)過度興奮不僅是心衰綜合征的主要表現(xiàn)，而且與心衰的嚴(yán)重程度和預(yù)后不良關(guān)系密切。雖然，臨床上針對交感神經(jīng)過度興奮的治療措施已被證明對慢性心衰病人是有益的，但心衰時交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng)的機(jī)制還不完全清楚。下丘腦室旁核（PVN）是神經(jīng)內(nèi)分泌活動的重要調(diào)節(jié)中樞，也是調(diào)節(jié)細(xì)胞外液容量和交感神經(jīng)驅(qū)動的關(guān)鍵腦區(qū)。近期研究發(fā)

2、現(xiàn)心衰大鼠下丘腦室旁核Fra-LI （中樞神經(jīng)元慢性激活狀態(tài)的標(biāo)記物）和促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）免疫雙標(biāo)陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，CRH 釋放增加，外周交感神經(jīng)活動增強(qiáng)，心功能不斷惡化；而且眾多參與心血管活動調(diào)節(jié)的活性物質(zhì)在該區(qū)域積聚，提示室旁核CRH 神經(jīng)元的激活與心衰的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。神經(jīng)解剖學(xué)研究證實(shí)，PVN內(nèi)CRH 神經(jīng)元除投射到正中隆起，調(diào)節(jié)腺垂體促腎上腺皮質(zhì)激素的釋放，發(fā)揮神經(jīng)內(nèi)分泌功能外；還有一些CRH 神經(jīng)元直

3、接投射到延髓頭端腹外側(cè)區(qū)和脊髓灰質(zhì)中間外側(cè)柱，通過調(diào)節(jié)這些區(qū)域的自主神經(jīng)核團(tuán)，發(fā)揮調(diào)節(jié)交感輸出的作用。由此我們推測，心衰時室旁核CRH 神經(jīng)元被激活，并參與交感神經(jīng)活動增強(qiáng)，加重心功能惡化。
　　 近期研究提示，心衰時中樞內(nèi)前列腺素E2 （PGE2）和去甲腎上腺素（NE）升高，可能是激活室旁核CRH 神經(jīng)元的兩個重要因素。此外，由于室旁核CRH 神經(jīng)元接受來自中樞神經(jīng)系統(tǒng)縝密的神經(jīng)支配。這些支配中，除正常情況下起主導(dǎo)作用的GAB

4、A能支配外，還有腎上腺素能以及谷氨酸能支配等。而γ-氨基丁酸（GABA）是PVN內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，谷氨酸和NE是重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。因此我們推測，心衰時中樞內(nèi)升高的PGE2和NE 可能直接激活室旁核CRH 神經(jīng)元，也可能作用于室旁核神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)而激活CRH 神經(jīng)
　　元，導(dǎo)致交感神經(jīng)活動增強(qiáng)。
　　 為探明以上推測，本研究首先觀察了慢性心衰時PVN內(nèi)CRH的表達(dá)變化以及CRH 神經(jīng)元激活與交感神經(jīng)活動增強(qiáng)之間的

5、關(guān)系。隨后，本研究通過側(cè)腦室慢性給予環(huán)氧合酶-2 抑制劑塞來考昔（CEL）以及選擇性αl 腎上腺素能受體阻滯劑哌唑嗪（PRA），對心衰時中樞內(nèi)升高的PGE2和NE是否為室旁核CRH 神經(jīng)元的激活物進(jìn)行了驗(yàn)證，并觀察了PVN內(nèi)GABA、谷氨酸和NE及其相應(yīng)的限速酶谷氨酸脫羧酶（GAD67）和酪氨酸羥化酶（TH）在其中的可能作用。由于氣態(tài)神經(jīng)遞質(zhì)一氧化氮（NO）可以通過調(diào)節(jié)多種神經(jīng)遞質(zhì)來發(fā)揮其交感調(diào)節(jié)作用，因此，本研究還觀察了神經(jīng)元型一氧化

6、氮合酶（Nnos）在上述病理過程中的可能作用。下丘腦室旁核CRH 神經(jīng)元在心衰發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其機(jī)制研究是心衰研究領(lǐng)域的一個新熱點(diǎn)，該機(jī)制的闡明將有助于心衰治療的研究。第一部分下丘腦室旁核CRH 神經(jīng)元激活在慢性充血性心力衰竭中的交感興奮作用
　　
　　 目的：觀察慢性心衰時PVN內(nèi)CRH的表達(dá)變化，以及CRH 神經(jīng)元的激活與交感神經(jīng)活動增強(qiáng)之間的關(guān)系。方法：實(shí)驗(yàn)分兩部分。首先，選取SD大鼠，采用冠狀動脈左前降支結(jié)

7、扎致心肌梗死制備心衰模型，假手術(shù)對照只穿線不結(jié)扎。所有動物經(jīng)側(cè)腦室插管連接滲透壓泵持續(xù)給藥4周（假手術(shù)對照組和心衰模型組給予空白對照人工腦脊液0.25μl/h，心衰模型給藥組給予CRH 競爭性抑制劑αh-CRH 15 μg/h）。第二，選取體內(nèi)CRH 合成不足的Lewis大鼠與同源純種Fischer 344大鼠，同樣采用冠脈結(jié)扎術(shù)制備心衰模型和假手術(shù)對照，進(jìn)行對比研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，保證各組至少有12只動物存活。4周后，各組大鼠（SD、L

8、ewis和Fischer）測定血流動力學(xué)指標(biāo)左室舒張末壓（LVEDP）和左室內(nèi)壓最大上升和下降速率（±dp/dtmax）評價心功能；測定右心室/體重比（RV/ BW）和肺/體重比（lung/BW）反映左心室前負(fù)荷變化；電生理記錄腎交感神經(jīng)放電活動（RSNA），ELISA 測定血漿去甲腎上腺素（NE）濃度，作為交感神經(jīng)興奮性指標(biāo)；免疫組織化學(xué)染色和western blot 測定PVN內(nèi)CRH的表達(dá)，ELISA 測定血漿促腎上腺皮質(zhì)激素（A

9、CTH）含量，評價室旁核CRH 神經(jīng)元激活情況。結(jié)果：（1）SD大鼠：心衰模型組大鼠與假手術(shù)對照組相比，PVN內(nèi)CRH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)目和CRH蛋白含量均明顯增加（相應(yīng)地外周血ACTH 升高）（p<0.05），伴有RSNA 增強(qiáng)和外周血NE 增加（p<0.05），而且LVEDP、lung/BW和RV/ BW 增加（p<0.05），±dp/dtmax降低（p<0.05）；心力衰竭模型術(shù)后側(cè)腦室慢性給予αh-CRH 可明顯逆轉(zhuǎn)以上各種表現(xiàn)（

10、p<0.05）。（2）Fisher大鼠：心衰模型組和相應(yīng)假手術(shù)對照相比，PVN內(nèi)CRH 神經(jīng)元活性增強(qiáng)（CRH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)目和蛋白含量均明顯增加，血漿內(nèi)ACTH 升高）（p<0.05），交感神經(jīng)活動增強(qiáng)（RSNA 增強(qiáng)，外周血NE 升高）（p<0.05），LVEDP和RV/ BW、lung/BW增加（p<0.05），±dp/dtmax下降（p<0.05）。（3）Lewis大鼠：心衰模型組和相應(yīng)假手術(shù)對照相比，PVN內(nèi)CRH免疫陽性神

11、經(jīng)元數(shù)目和蛋白含量雖略有增加，但尚不具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05）；外周血ACTH 含量的變化與室旁核內(nèi)CRH 含量改變相一致（p＞0.05）；RSNA 沒有明顯增強(qiáng)（p＞0.05），血漿內(nèi)NE水平也沒有顯著增加（p＞0.05）；心功能得以很好保持（LVEDP和±dp/dtmax及RV/ BW、lung/BW 改變均不明顯）（p＞0.05）。結(jié)論：慢性心衰時，下丘腦室旁核CRH 神經(jīng)元被激活，并可增強(qiáng)外周交感神經(jīng)活動，加重心功能惡化。<

12、br>　　
　　 第二部分 慢性充血性心力衰竭時
　　 中樞前列腺素E2與下丘腦室旁核CRH 神經(jīng)元激活的關(guān)系
　　 目的：驗(yàn)證慢性心衰時，中樞內(nèi)升高的PGE2是否為PVN內(nèi)CRH 神經(jīng)元的激活因素，并探討可能的激活機(jī)制。方法：選取SD大鼠，采用冠脈結(jié)扎術(shù)制備心衰模型，假手術(shù)對照只穿線不結(jié)扎。所有動物經(jīng)側(cè)腦室插管連接滲透壓泵持續(xù)給藥4周（假手術(shù)對照組和心衰模型組給予空白對照人工腦脊液0.25μl/h，心衰模型給

13、藥組給予環(huán)氧合酶-2 抑制劑CEL20μg/h）。4周后，各組大鼠血流動力學(xué)測定LVEDP和±dp/dtmax；測定RV/ BW和lung/BW；電生理記錄RSNA，ELISA 測定血漿ACTH和NE及腦脊液PGE2濃度；免疫組織化學(xué)染色和western blot 測定PVN內(nèi)CRH、TH、GAD67和Nnos的表達(dá)；高效液相色譜（HPLC）測定PVN內(nèi)NE、谷氨酸和GABA 含量。結(jié)果：（1）與假手術(shù)對照組相比，心衰模型組大鼠腦脊液內(nèi)

14、PGE2 含量明顯增加（p<0.05）；PVN內(nèi)CRH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯增多，CRH蛋白含量明顯增加，外周血ACTH 升高（p<0.05）；并且RSNA 增強(qiáng)，外周血NE 升高（p<0.05）；LVEDP、RV/ BW和lung/BW 明顯增加，±dp/dtmax 明顯下降（p<0.05）。側(cè)腦室給予環(huán)氧合酶-2 抑制劑CEL后，心衰大鼠腦脊液內(nèi)PGE2 明顯下降，PVN內(nèi)CRH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)目和蛋白含量均有所降低，外周血ACTH

15、水平下降（p<0.05）；同時RSNA和血漿NE降低（p<0.05）；LVEDP、RV/ BW和lung/BW 有所下降，±dp/dtmax 有所升高（p<0.05）。（2）與假手術(shù)對照組相比，心衰模型組大鼠PVN內(nèi)谷氨酸、NE和TH 含量較高，GABA、GAD67和Nnos 較低（p<0.05）；側(cè)腦室慢性給予CEL后，PVN內(nèi)谷氨酸、NE和TH下降，GABA、GAD67和Nnos增加（p<0.05）。結(jié)論：慢性心衰時，中樞內(nèi)升高的P

16、GE2 可以激活下丘腦室旁核CRH 神經(jīng)元參與交感神經(jīng)活動增強(qiáng)，而該作用可能通過改變下丘腦室旁核神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)。
　　
　　 第三部分 慢性充血性心力衰竭時
　　 中樞去甲腎上腺素與下丘腦室旁核CRH 神經(jīng)元激活的關(guān)系
　　 目的：驗(yàn)證慢性心衰時，中樞內(nèi)升高的NE是否為PVN內(nèi)CRH 神經(jīng)元的激活因素，并探討可能的激活機(jī)制。方法：SD大鼠，心衰模型及給藥方法同第二部分。實(shí)驗(yàn)動物分三組：假手術(shù)對照組和心

17、衰模型組給予空白對照人工腦脊液0.25μl/h，心衰模型給藥組給予選擇性αl 受體阻滯劑PRA 10nmol/h。同樣，4周后測定心功能指標(biāo)LVEDP和±dp/dtmax；左室前負(fù)荷指標(biāo)RV/ BW和lung/BW；交感神經(jīng)興奮性指標(biāo)RSNA和血漿NE。另外，ELISA 測定血漿ACTH濃度；免疫組織化學(xué)染色和western blot 測定PVN內(nèi)CRH、TH、GAD67和Nnos的表達(dá)；高效液相色譜測定PVN內(nèi)NE、谷氨酸和GABA

18、含量。結(jié)果：（1）與假手術(shù)對照組相比，心衰模型組大鼠PVN內(nèi)NE 含量及其限速酶TH表達(dá)明顯增加，CRH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)目和蛋白含量明顯增加，外周血ACTH 升高（p<0.05）；伴有RSNA 增強(qiáng)和外周血NE 升高（p<0.05）；LVEDP、RV/ BW和lung/BW 增加，±dp/dtmax 明顯下降（p<0.05）。側(cè)腦室慢性給予PRA后，PVN內(nèi)CRH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，CRH蛋白含量降低，外周血ACTH水平下降（p

19、<0.05）；而且RSNA 減弱，血漿NE降低（p<0.05）；LVEDP、RV/ BW和lung/BW下降，±dp/dtmax 升高（p<0.05）。（2）與假手術(shù)對照組相比，心衰模型組大鼠PVN內(nèi)谷氨酸濃度增加，GABA、Nnos和GAD67 含量下降（p<0.05）；側(cè)腦室慢性給予PRA后，PVN內(nèi)谷氨酸下降，GABA、Nnos和GAD67 有所增加（p<0.05）。結(jié)論：慢性心衰時，中樞內(nèi)特別是下丘腦室旁核升高的NE 可以激活室