一種新茶樹病害鑒定及其檢測技術(shù)研究.pdf

1、湖北省是我國主要蕉葉產(chǎn)區(qū)之一，茶樹病害種類多，部分病害普遍發(fā)生，嚴(yán)重危害茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究調(diào)查了湖北省內(nèi)茶樹葉部病害的發(fā)生種類，對茶樹病原真菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，鑒定新病害一種，并開發(fā)了一種快速靈敏的茶樹病原菌的檢測技術(shù)。取得的研究結(jié)果如下:
　　1本研究于2013年和2014年對湖北省5個(gè)茶葉主產(chǎn)區(qū)160個(gè)茶園的主要茶樹葉部病害進(jìn)行了調(diào)查。結(jié)果表明，湖北省共發(fā)生15種茶樹葉部病害，恩施州6種，十堰市10種、宜昌市8

2、種、黃岡市1種、武漢市11種。在所有發(fā)現(xiàn)的茶樹葉部病害中，發(fā)生普遍或危害嚴(yán)重的茶真菌病害主要有茶褐色斑點(diǎn)病、茶云紋葉枯病、茶餅病、茶輪斑病、茶炭疽病、茶褐色葉斑病、茶胴枯病、茶煤病、茶赤葉斑病、茶白星病等9種病害。茶云紋葉枯病和茶炭疽病發(fā)生最普遍，在所有5個(gè)大區(qū)的茶園都有不同程度的發(fā)生，其它幾種病害在不同地區(qū)的發(fā)病率高低不等，發(fā)病率在0～15.8％。統(tǒng)計(jì)顯示，湖北省西部恩施州和中部宜昌市的發(fā)病程度更低，病情指數(shù)為9.3～19.8，西北部

3、十堰市、東部黃岡市和武漢市發(fā)病更嚴(yán)重，病情指數(shù)為9.9～28.5。這種較高程度的地域相關(guān)性可能和當(dāng)?shù)夭枞~質(zhì)量安全示范區(qū)建設(shè)有關(guān)。在病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，茶褐色斑點(diǎn)病是一種新的茶樹病害，與茶輪斑病、茶白星病、茶褐色圓星病的典型癥狀有明顯差別。
　　2調(diào)查發(fā)現(xiàn)，茶葉上存在一種新的褐色斑點(diǎn)病(病斑直徑為1～2mm)，但其病原菌尚不明確。從湖北省恩施州宣恩縣、十堰市竹溪縣、黃岡市英山縣、武漢市新洲區(qū)等地區(qū)采集有褐色斑點(diǎn)病癥狀的葉片樣品，共分離純

4、化到54個(gè)真菌分離物。形態(tài)學(xué)和內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Ribosomal internal transcribed spacer，ITS)序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，12個(gè)分離物屬于擬莖點(diǎn)霉(Phomopsis spp.)，8個(gè)分離物屬于炭疽菌（Colletotrichum spp.），34個(gè)分離物屬于擬盤多毛孢（Pestalotiopsis spp.）。結(jié)合β-微管蛋白(β-tubulin，TUB2)和延伸因子(Translation elong

5、ation factor1-alpha，TEF1)基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果，34個(gè)盤多毛孢菌分離物分別屬于茶擬盤多毛孢菌(P.theae)（14個(gè)）、山茶擬盤多毛孢菌(P.camelliae)（12個(gè)）和棒形擬盤多毛孢菌(P.clavispora)（8個(gè)）。對其中7個(gè)擬盤多毛孢菌分離物TP1-2O、TP2-1A、TP2-2W、LT3-2O、LT4-1O、LT4-2B和PF2-8O進(jìn)行了重點(diǎn)分析。采用離體茶葉片進(jìn)行致病性分析顯示，有傷條

6、件下，無論菌絲塊或分生孢子懸浮液接種，擬盤多毛孢真菌的接種均可引起褐色小斑點(diǎn)(直徑1～2mm)，與田間觀察相似，而且茶擬盤多毛孢和棒形擬盤多毛孢致病力比山茶擬盤多毛孢強(qiáng);在無傷條件下，只有茶擬盤多毛孢具有致病性。茶擬盤多毛孢分生孢子懸液接種田間茶葉，也使葉片表現(xiàn)出了相同的黑點(diǎn)癥狀，且從發(fā)病葉上可以重新分離到該病原，證實(shí)茶擬盤多毛孢是褐色斑點(diǎn)病的病原菌。本研究的茶擬盤多毛孢菌(P.theae)分離物如TP1-2O和TP2-2W與茶輪斑病的

7、分離物比較，二者的分生孢子中間細(xì)胞顏色、頂端附屬絲末端形態(tài)、生長速率、致病性等方面有明顯差異，在DNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系方面也不同。這是第一次報(bào)道擬盤孢屬真菌可以在嫩茶葉上引起褐色斑點(diǎn)病。
　　3從十堰市竹溪縣和武漢市等地采集了具有典型茶云紋葉枯病、茶輪斑病、茶炭疽病和茶胴枯病癥狀的病葉樣品，共分離了5個(gè)真菌分離物。根據(jù)菌落特征和顯微觀察結(jié)果，分離物ZX3-1、HN-40和HN-1分別屬于油茶刺盤孢菌Collectotrichum

8、 camelliae、茶擬盤多毛孢菌P.thea和膠孢炭疽菌C.gloeosporioides，另外2個(gè)分離物HN-15和HN-42為莖點(diǎn)霉屬真菌Phoma spp.。所有分離物的鑒定都嚴(yán)格按照科赫氏法則的分離、致病性測試、再分離和鑒定等步驟進(jìn)行，這些分離物可能是引起原有癥狀的相關(guān)病原菌。ITS序列或交配型蛋白2(Mating protein2，MAT2)基因序列的分析與形態(tài)學(xué)鑒定基本一致，證實(shí)了這5個(gè)分離物的分類地位。本研究首次發(fā)現(xiàn)，

9、茶炭疽病原菌膠孢炭疽菌C.gloeosporioides分離物HN-1和茶胴枯病原菌莖點(diǎn)霉菌Phoma spp.分離物HN-15和HN-42對茶樹葉片具有一定的致病性，但是否可以在野外直接引起這些病害癥狀，還需要進(jìn)一步研究。
　　4針對茶刺盤孢菌C.camelliae、茶擬盤多毛孢菌P.theae和莖點(diǎn)霉菌Phoma spp.設(shè)計(jì)了3對特異引物和3條TaqMan探針;建立了茶褐色斑點(diǎn)病、茶云紋葉枯、茶輪斑病和茶胴枯病等病害病原菌的

10、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測技術(shù)。靈敏性分析表明，1～10pg/μL的純培養(yǎng)物DNA足以獲得強(qiáng)烈的熒光信號，比常規(guī)PCR的靈敏性高很多。應(yīng)用這一技術(shù)，成功檢測了茶云紋葉枯病原菌油茶刺盤孢菌Colletotrichum camelliae分離物ZX3-1，但不能檢測同一真菌屬的芒果炭疽病原菌膠孢炭疽菌C.gloeosporioides和草莓炭疽病原菌芳香刺盤孢菌C.fragariae，顯示這一套引物和探針具有高度的特異性;，也成功檢測了茶褐色