基于表面等離子共振技術(shù)的活性蛋白濃度絕對定量方法研究.pdf

1、蛋白質(zhì)有著多樣而復雜的結(jié)構(gòu)，是生命體的重要組成部分，具有多種多樣的生物學功能，廣泛參與到人的生命活動中，這引起了藥物開發(fā)和臨床診斷等行業(yè)強烈的關注。蛋白的活性濃度數(shù)據(jù)是理解蛋白質(zhì)相互作用所需的最重要的數(shù)據(jù)，現(xiàn)階段缺乏可追溯到國際單位（SI單位）的測量活性蛋白的基本分析方法，這意味著目前沒有用于活性蛋白的計量標準，無法建立活性蛋白的溯源鏈。這已經(jīng)成為藥物開發(fā)和臨床診斷等發(fā)展的障礙，并導致基于蛋白活性的測量的問題，例如免疫測定中的互通性問題

2、。
　　本文基于對人體健康的關注，從轉(zhuǎn)基因作物和疾病診斷兩個方面入手，選取了植物源G2-EPSPS轉(zhuǎn)基因蛋白和人心肌紅蛋白(hMYO)兩個目標物進行了研究，提出了基于表面等離子共振技術(shù)(SPR)的無標定量法（Calibration-free Concentration Analysis（CFCA法）），初步建立起可追溯到SI單位的活性靶標蛋白絕對定量方法。
　　首先用CFCA法對G2-EPSPS和hMYO的活性濃度進行絕對定

3、量，包括對蛋白樣品的純度、分子量和擴散系數(shù)等信息進行了鑒定，對實驗過程中的條件，如抗體偶聯(lián)溶液的pH、再生試劑和偶聯(lián)密度等進行篩選和優(yōu)化，在最優(yōu)條件下對G2-EPSPS蛋白和hMYO進行活性濃度的絕對定量，得到的活性濃度分別為2778.6nM和62733.9nM。對所建立的方法進行方法學考察，日內(nèi)精密度分別為3.26％～4.59％和2.50％～4.23％，日間精度分別為8.36％和3.12％，具有良好的的重復性、再現(xiàn)性。然后用同位素稀釋

4、質(zhì)譜法（IDMS法）對G2-EPSPS和hMYO準確測定其總蛋白濃度，與各自的活性濃度相比，活性蛋白分別占總蛋白的17.89％和43.03％。最后在準確的活性蛋白濃度基礎上，對G2-EPSPS和hMYO和他們對應的抗體之間的相互作用進行了動力學研究，得到更可靠的結(jié)合常數(shù)ka、解離常數(shù)kd、親和力常數(shù)kD，分別為2.18×106M-1s-1、5.79×10-3s-1、2.65×10-9M和2.58×106M-1s-1、2.30×10-3s