漢族兒童NKG2-C基因缺失及體外Hpa、氯酸鈉聯(lián)合作用與HCMV感染的相關(guān)性研究.pdf

1、第一部分：
　　 漢族兒童NKG2-C基因缺失與巨細(xì)胞病毒感染相關(guān)性研究
　　 目的：本實驗通過收集兒童血標(biāo)本，用不同的檢測方法檢測外周血基因組中有無NKG2-C基因片段的缺失。確定兒童中NKG2-C基因片段的缺失率，并確定在臨床上有感染人巨細(xì)胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV)明顯癥狀的患兒，他們是否存在NKG2-C缺失。為以后巨細(xì)胞病毒的診斷與治療尋找新的方法提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法

2、：在江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院收集104份患兒血液標(biāo)本，將其分為巨細(xì)胞病毒感染組(HCMV+)與非巨細(xì)胞病毒感染組(HCMV-)。提取基因組DNA、設(shè)計引物、做普通PCR得到NKG2-C的基因片段。用所獲得的基因片段樣本做瓊脂糖凝膠電泳，通過紫外檢測儀曝光檢測有無相應(yīng)基因長度的條帶顯示在瓊脂糖膠上。篩選出缺失樣本與帶有NKG2-C基因的基因組樣本作為對照為一組，已做過普通PCR后的NKG2-C基因片段樣本為一組，兩組都送基因測序公司測序。

3、r>　　 結(jié)果：在HCMVˉ組中患兒中NKG2-C純合子缺失大約有4.16％。根據(jù)Hardy-Weinberg假設(shè)原理，計算出等位基因缺失概率約20.4％。在HCMV+中患兒NKG2-C純合子缺失大約有50％。兩組相比，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，采用卡方檢驗中Yates校正公式計算出x2＝15.9，x2＞x20.05，P＜0.005，得出兩組NKG2-C基因片段的缺失相比差異是有明顯統(tǒng)計學(xué)意義的結(jié)論。
　　 結(jié)論：實驗研究

4、結(jié)果表明容易感染HCMV的兒童可能與其NKG2-C的缺失有關(guān)。本實驗研究為以后巨細(xì)胞病毒的診斷與治療都提供了理論依據(jù)。
　　 第二部分：
　　 肝素酶聯(lián)合氯酸鈉體外抗人巨細(xì)胞病毒的作用
　　 目的：研究在體外用肝素酶與氯酸鈉干預(yù)人胚肺成纖維細(xì)胞（Humanembryoniclungfibroblast，HELF），觀察人巨細(xì)胞病毒感染干預(yù)HELF后的細(xì)胞病變，為證明細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素(heparansulfa

5、te，HS)與HCMV感染人胚胎成纖維細(xì)胞的吸附過程的關(guān)系。
　　 方法：1.測定HCMVAD169對HELF的毒力已長成單層HELF細(xì)胞培養(yǎng)板中加入10-1-10-7的HCMV病毒懸液，設(shè)正常細(xì)胞組為對照組，各組設(shè)8個復(fù)孔。當(dāng)觀察到細(xì)胞特征性病變效應(yīng)(CPE)不再有變化時，記錄出現(xiàn)CPE的孔數(shù)，按照Reed-Muench法計算半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(TCID50)。
　　 2.測定氯酸鈉對HELF的毒性將不同濃度的氯酸鈉分

6、別加入已長成單層HELF細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)5個復(fù)孔，同時設(shè)不加氯酸鈉的HELF為對照組。當(dāng)?shù)怪蔑@微鏡下觀察到的細(xì)胞病變不再有變化約7天時，用MTT比色法測定每孔的4490值。計算細(xì)胞存活率(CSR)、半數(shù)中毒濃度(TD50)，推算出最大無毒濃度(TD0)。
　　 3.分組并進(jìn)行熒光定量-PCR檢測根據(jù)不同的干預(yù)方法分為:細(xì)胞組(A)、病毒組(B)、氯酸鈉組(C)、肝素酶組(D)、聯(lián)合用藥組(E)。提取各組細(xì)胞內(nèi)HCMVDNA，然后

7、對其DNA提取液進(jìn)行熒光定量-PCR檢測。
　　 結(jié)果：
　　 1.本實驗測得的HCMV對HELF細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50)=10-4.4/0.1mL。
　　 2.氯酸鈉的最大無毒濃度(TD0)為40Mmol/L。
　　 3.B-E組HCMVDNA載量的均值分別為2.0735×106copies/50mg、6.4140×105copies/50mg、6.104×105copies/50mg、1.737