成骨細胞復合TCP異體移植成骨情況及免疫學檢測.pdf

1、目的：研究不同來源成骨細胞體外培養(yǎng)的形態(tài)特征和生物學活性，探討成骨細胞分離培養(yǎng)的最佳方法及作為骨組織工程種子細胞的可行性和應用價值，為骨組織工程的研究提供穩(wěn)定可靠的種子細胞來源。方法：無菌條件下取新生新西蘭兔脛骨骨膜和骨髓，PBS沖洗3次，0.25％胰蛋白酶消化20分鐘，以徹底去除殘留在組織塊上的血污，再將骨膜剪成大小約為1×1mm的組織塊，將骨膜組織塊放入25ml培養(yǎng)瓶中，加入含10％小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液2ml，細胞長滿瓶底后

2、進行傳代培養(yǎng)。注射器肝素化后抽取完全DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，將混合DMEM培養(yǎng)液加入到無菌離心管內，1000轉/分鐘離心，去除最上面的脂肪層，以1×106/cm2密度接種于100ml培養(yǎng)瓶中進行原代細胞培養(yǎng)。3天后全量換液，細胞匯合成單層后用0.25％胰蛋白酶消化細胞進行傳代培養(yǎng)。細胞傳代后改用含地塞米松(1×10-8mol/l)、β-甘油磷酸鈉(10mmol/l)、維生素C(50mg/ml)的條件培養(yǎng)液培養(yǎng)。取第5代生長旺盛的成骨細

3、胞，胰蛋白酶消化后，以107/ml的濃度封入凍存管進行超低溫凍存，一個月后復蘇，以106/ml的濃度接種在含有5mlDMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。每種方法培養(yǎng)的細胞每日在相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)，通過Gomori鈣鈷法進行堿性磷酸酶染色，vonKossa法進行鈣結節(jié)染色，觀察細胞體外基質分泌和骨化過程。 結果：骨膜培養(yǎng)第3天可見少量的梭形細胞從組織塊周圍游出，隨培養(yǎng)時間延長細胞數量逐漸增多，圍繞組織塊周圍呈放射狀生長，10天時

4、細胞融合成單層。傳代后的細胞呈梭形、多角形，帶有粗大的突起，4天時融合成單層。組織塊培養(yǎng)的原代和傳代細胞均有活躍的增殖能力，堿性磷酸酶染色及鈣結節(jié)染色陽性。骨髓培養(yǎng)剛接種時細胞呈球形懸浮于培養(yǎng)液中，4～5天時貼壁細胞開始增殖呈克隆樣生長，10～12天細胞長滿瓶底。細胞傳代后5天匯合成單層，細胞增殖旺盛，骨髓培養(yǎng)的原代細胞堿性磷酸酶染色陽性率低于傳代后細胞的陽性率。傳代細胞堿性磷酸酶染色陽性率高，鈣結節(jié)染色呈陽性。 結論：兩種來源

5、的細胞均表現典型成骨細胞的形態(tài)特征和較強的生物學活性，均可作為骨組織工程種子細胞的可靠來源。細胞凍存復蘇后形態(tài)特征和生物學活性變化不大，可作為保存細胞的一種方法。 目的觀察成骨細胞同種異體移植的成骨情況及免疫反應，比較凍存成骨細胞和未凍存細胞在成骨能力和免疫原性方面的差異，探討同種異體成骨細胞移植的可行性，為進一步的研究奠定基礎。 方法取新生新西蘭大白兔脛骨骨髓，分離后加入條件培養(yǎng)液體外培養(yǎng)原代成骨細胞，細胞傳代后，對細

6、胞進行形態(tài)學、堿性磷酸酶(ALP)染色及體外礦化能力的檢測。取第5代生長旺盛的細胞一部分進行動物體內試驗，另一部分采用超低溫凍存的方法保存，1個月后復蘇，取復蘇后生長旺盛的細胞進行動物實驗，與未凍存細胞在成骨情況、免疫反應方面進行比較。將凍存和未凍存的兩種細胞以2×107/ml濃度分別與磷酸三鈣(TCP)復合，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天后用于植入動物實驗。30只新西蘭大白兔為移植受體，隨機分為A、B、C三組，將兩種復合體和

7、單純TCP材料分別植入到兔腹直肌肌袋內，每組10只，共三組，A組(凍存細胞組)、B組(未凍存細胞組)、C組(單純材料組)。術后第1、2、4、8、12周分別取標本進行組織學觀察、血清特異性抗體檢測、淋巴細胞增殖試驗和淋巴細胞毒試驗。 結果實驗組各兔移植術后無一例發(fā)生感染，切口均為一期愈合，未見明顯全身及局部排斥反應，A、B兩組移植后第2、4周檢測到特異性抗體，8周時已檢測不到特異性抗體，細胞介導的細胞毒反應和淋巴細胞增殖反應于術后