重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠內(nèi)毒素血癥巨噬細(xì)胞的生物學(xué)特性.pdf

1、背景與目的：膿毒癥是嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、燒傷、外科大手術(shù)患者常見的并發(fā)癥，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致膿毒癥休克和多器官功能障礙綜合征(MODS)，是臨床危重患者死亡的最主要原因之一。全球膿毒癥患者總病例數(shù)約為1800萬/年，美國患病人數(shù)為75萬/年，歐洲為13.5萬/年。全世界死亡人數(shù)超過1.4萬/天，美國21.5萬/年，并成為美國非心臟ICU死亡的主因。目前對膿毒癥的認(rèn)識及治療措施有所改進(jìn)，但膿毒癥的病死率仍然居高不下，已成為現(xiàn)代危重病醫(yī)學(xué)面臨的突

2、出難題。根本原因源于膿毒癥的根本發(fā)病環(huán)節(jié)及作用機(jī)制尚未充分闡明，故而缺乏早期有效的預(yù)防與治療措施。
　　 失控的全身炎癥反應(yīng)是膿毒癥預(yù)后不良的重要原因之一。固有免疫細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的重要參與者，其異?；罨蓪?dǎo)致失控炎癥反應(yīng)的發(fā)生。感染相關(guān)的噬血細(xì)胞綜合征(IAHS)及重癥急性呼吸道綜合征(SARS)、重癥H1N1等高致死性流行病毒感染性疾病，其病理生理特點亦為失控的全身炎癥反應(yīng)綜合征。以上疾病存在著固有免疫細(xì)胞的異?；罨?，是疾病發(fā)

3、生的重要原因之一，但對于何種原因?qū)е鹿逃忻庖呒?xì)胞的異?；罨枰M(jìn)一步研究。近年的研究顯示了固有免疫細(xì)胞與適應(yīng)性免疫細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中相互作用的復(fù)雜性。我們的前期研究顯示T細(xì)胞缺陷裸鼠感染呼吸道合胞病毒(RSV)后，炎癥反應(yīng)重于野生型小鼠，提示T細(xì)胞可能抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生。Kim的研究顯示炎癥早期，淋巴細(xì)胞可抑制固有免疫細(xì)胞活化。由此，我們推測，膿毒癥，IAHS及SARS等的發(fā)生可能與機(jī)體體內(nèi)淋巴細(xì)胞不同程度功能缺陷導(dǎo)致固有免疫細(xì)胞異常活化相

4、關(guān)。若能對淋巴細(xì)胞缺陷動物膿毒癥中固有免疫細(xì)胞活化及功能特征進(jìn)行研究，也許能為以上疾病的發(fā)病環(huán)節(jié)及作用機(jī)制研究提供新的思路。
　　 內(nèi)毒素在革蘭陰性細(xì)菌感染所致膿毒癥的發(fā)病機(jī)制中扮演重要作用，甚至細(xì)菌血培養(yǎng)陰性時，也存在內(nèi)毒素血癥，提示內(nèi)毒素血癥可是膿毒血癥的單獨致病因素。內(nèi)毒素具有極廣泛而又復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)，膿毒癥病理過程中出現(xiàn)的失控炎癥反應(yīng)、免疫機(jī)能紊亂、高代謝狀態(tài)及多臟器功能損害均可由內(nèi)毒素直接或間接觸發(fā)。淋巴細(xì)胞缺陷的重

5、癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠革蘭陰性細(xì)菌感染模型的病理性免疫反應(yīng)(炎癥反應(yīng))取決于細(xì)菌的持續(xù)繁殖擴(kuò)散和宿主的免疫反應(yīng)。這一模型給研究單一免疫反應(yīng)帶來困難。為避免此類情況的發(fā)生，我們擬采用脂多糖(LPS)腹腔注射誘導(dǎo)T、B細(xì)胞缺陷重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠內(nèi)毒素血癥，通過觀察SCID小鼠巨噬細(xì)胞生物學(xué)特性，從而揭示淋巴細(xì)胞缺陷對炎癥反應(yīng)的影響以及對巨噬細(xì)胞活化的調(diào)控作用及其作用可能的分子機(jī)制，為膿毒癥的防治提供新的方向和理論依據(jù)。
　　

6、 第一部分、脂多糖誘導(dǎo)的BALB/c小鼠與SCID小鼠內(nèi)毒素血癥炎癥反應(yīng)的比較
　　 目的：在LPS誘導(dǎo)的BALB/c小鼠和SCID小鼠內(nèi)毒素血癥模型基礎(chǔ)上，比較兩種小鼠炎癥反應(yīng)的差異，觀察淋巴細(xì)胞缺陷對固有免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)的影響。
　　 方法：LPS腹腔注射BALB/c小鼠和SCID小鼠后，觀察小鼠的一般狀況及存活率。將32只雄性BALB/c小鼠和32只雄性SCID小鼠隨機(jī)分為正常對照組，LPS注射后3 h，6 h

7、和12 h組。取小鼠的血清，肝臟及肺臟組織；用全自動生化分析儀檢測兩種小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)及血尿素氮(BUN)水平；用H.E染色，雙盲法評估肝臟，肺臟的炎癥病理損傷；用流式細(xì)胞術(shù)微球陣列法(CBA)檢測兩種小鼠血清TNF-α，IFN-γ，IL-10，IL-6及MCP-1的水平；用ELISA檢測兩種小鼠血清IL-12，IL-4及IL-17的水平及肝組織勻漿TNF-α及IL-10的水平。
　　 結(jié)果：L

8、PS誘導(dǎo)內(nèi)毒素血癥后，SCID小鼠于12～24 h均死亡(8/8)，BALB/c小鼠僅1只死亡(1/8)；LPS注射后12 h，SCID小鼠血清ALT、AST均高于BALB/c小鼠，兩種小鼠BUN無顯著差異；SCID小鼠肝臟、肺臟病理評分均高于BALB/c小鼠：LPS注射后，兩種小鼠血清TNF-α，IFN-γ，IL-10，IL-6，MCP-1及IL-4的水平均顯著升高，且SCID小鼠以上細(xì)胞因子水平明顯高于BALB/c小鼠；LPS注射后

9、3 h，SCID小鼠肝組織勻漿TNF-α水平高于BALB/c小鼠，注射后6 h，IL-10水平高于BALB/c小鼠。
　　 結(jié)論：LPS誘導(dǎo)小鼠內(nèi)毒素血癥后，與野生型BALB/c小鼠比較，SCID小鼠分泌過量的炎性及抗炎細(xì)胞因子，出現(xiàn)失控的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致嚴(yán)重的臟器損傷，是SCID小鼠死亡的重要原因。固有免疫應(yīng)答在缺乏淋巴細(xì)胞的狀態(tài)下異常增強(qiáng)，可能是發(fā)生危及生命的重癥全身炎癥反應(yīng)綜合征的重要原因。
　　 第二部分、脂多糖誘

10、導(dǎo)的BALB/c小鼠與SCID小鼠內(nèi)毒素血癥腹腔巨噬細(xì)胞活化及功能的比較
　　 目的：在LPS誘導(dǎo)的BALB/c小鼠和SCID小鼠內(nèi)毒素血癥模型基礎(chǔ)上，比較BALB/c小鼠及SCID小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活化及功能的差異。觀察淋巴細(xì)胞缺陷對巨噬細(xì)胞活化及功能的影響。
　　 方法：將40只雄性BALB/c小鼠和40只雄性SCID小鼠各自隨機(jī)分為正常對照組，LPS注射后1h，3h，6h和12h組。取小鼠的腹腔灌洗液，腹腔巨噬細(xì)胞和

11、小鼠脾臟NK細(xì)胞；用ELISA檢測腹腔灌洗液TNF-α和IL-10的水平；用實時熒光定量PCR檢測腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α和IL-10 mRNA表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測BALB/c小鼠及SCID小鼠正常對照組及LPS注射后3 h組腹腔巨噬細(xì)胞TLR4，MHC-Ⅱ，CD80，CD86及CD40的表達(dá)及LPS注射后12 h脾臟NK細(xì)胞胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ水平；雞紅細(xì)胞吞噬實驗檢測兩種小鼠正常對照組腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能；并提取兩種小鼠正常對照組腹

12、腔巨噬細(xì)胞體外LPS刺激培養(yǎng)，測定上清中TNF-α，IL-6，IL-10，IL-17及IFN-γ的水平。
　　 結(jié)果：LPS注射后1 h，SCID小鼠腹腔灌洗液TNF-α水平高于BALB/c小鼠，注射后3 h，IL-10水平明顯低于BALB/c小鼠；正常對照組及LPS注射后3 h，6 h和12 h組，SCID小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-αmRNA表達(dá)高于BALB/c小鼠；正常對照組及LPS注射后各時間點，SCID小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL

13、-10 mRNA表達(dá)均低于BALB/c小鼠。BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率及吞噬指數(shù)均高于SCID小鼠腹腔巨噬細(xì)胞；LPS注射后，BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLR4，MHC-Ⅱ，CD80，CD86表達(dá)均明顯升高，SCID小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLR4，MHC-Ⅱ，CD86表達(dá)無明顯變化，BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞CD40及SCID小鼠腹腔巨噬細(xì)胞CD80，CD40均明顯下降；SCID小鼠NK細(xì)胞胞內(nèi)IFN-γ平均熒光值高于BALB

14、/c小鼠NK細(xì)胞。體外實驗LPS刺激20h后，SCID小鼠腹腔巨噬細(xì)胞較BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌更多的TNF-α，IL-6，但I(xiàn)L-10的分泌明顯偏少。
　　 結(jié)論：與野生型BALB/c小鼠比較，SCID小鼠腹腔巨噬細(xì)胞共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)自發(fā)性增高，吞噬功能明顯下降。經(jīng)LPS刺激后，腹腔巨噬細(xì)胞TLR4和MHC-Ⅱ和CD80、CD86分子表達(dá)無增高，但分泌的炎性細(xì)胞因子顯著增加，且NK細(xì)胞胞內(nèi)IFN-水平

15、增高。以上表現(xiàn)是SCID小鼠內(nèi)毒素血癥炎癥反應(yīng)失控的主要特點。
　　 第三部分、MKP-1在淋巴細(xì)胞對巨噬細(xì)胞活化調(diào)控中的作用
　　 目的：在LPS誘導(dǎo)的BALB/c小鼠和SCID小鼠內(nèi)毒素血癥模型基礎(chǔ)上，篩選出可能參與淋巴細(xì)胞對巨噬細(xì)胞活化調(diào)控的信號分子。于體外建立單獨腹腔巨噬細(xì)胞組及腹腔巨噬細(xì)胞+pan-T細(xì)胞混合培養(yǎng)組模型，采用LPS刺激后，明確所篩選出分子的表達(dá)及作用。
　　 方法：將40只雄性BALB/

16、c小鼠和40只雄性SCID小鼠各自隨機(jī)分為正常對照組，LPS注射后1 h，3 h，6 h和12 h組。提取腹腔巨噬細(xì)胞；采用實時熒光定量PCR檢測腹腔巨噬細(xì)胞SOCS1，SOCS3及MKP-1的mRNA表達(dá)，免疫熒光檢測腹腔巨噬細(xì)胞MKP-1蛋白表達(dá)。提取BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞及脾臟pan-T細(xì)胞建立單獨腹腔巨噬細(xì)胞組及腹腔巨噬細(xì)胞+pan-T細(xì)胞混合培養(yǎng)組模型；LPS刺激后，提取貼壁腹腔巨噬細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清；實時熒光定量PCR

17、檢測MKP-1mRNA的表達(dá)；Western Blot檢測腹腔巨噬細(xì)胞MKP-1蛋白表達(dá)水平；用ELISA檢測上清中TNF-α、IL-6及IL-10的水平。
　　 結(jié)果：在LPS注射后3 h及6 h，SCID小鼠腹腔巨噬細(xì)胞SOCS1mRNA表達(dá)明顯高于BALB/c小鼠；在LPS注射后1 h及12 h，BALB/c小鼠SOCS3表達(dá)明顯高于SCID小鼠。正常對照組及LPS注射后，BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞MKP-1 mRNA的

18、表達(dá)均高于SCID小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。體外實驗，LPS刺激后，腹腔巨噬細(xì)胞與pan-T細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞中腹腔巨噬細(xì)胞MKP-1 mRNA及蛋白表達(dá)高于單獨培養(yǎng)腹腔巨噬細(xì)胞；上清中TNF-α、IL-6水平明顯低于單獨培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，IL-10水平無顯著差異。
　　 結(jié)論：內(nèi)毒素血癥小鼠淋巴細(xì)胞并非通過SOCS1和SOCS3信號分子調(diào)控巨噬細(xì)胞活化。Pan-T細(xì)胞可抑制LPS刺激下巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子釋放。在LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)小鼠模型中淋