Rab1介導(dǎo)的AT1R囊泡運(yùn)輸對(duì)低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及活性的影響.pdf

1、背景和目的：
　　 與處于終末期分化狀態(tài)的骨骼肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞不同，成年哺乳動(dòng)物血管平滑肌細(xì)胞仍保持著高度的可塑性，當(dāng)受到損傷時(shí)，可以發(fā)生可逆的表型轉(zhuǎn)化。血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化在人類多種疾病扮演著重要角色，如動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄、肺動(dòng)脈高壓和平滑肌腫瘤都與血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化有著密切的關(guān)系。低氧可誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，并且與多種信號(hào)分子有關(guān)，新近的研究表明血管緊張素II 參與了低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖。

2、　　 血管緊張素II是一種辛肽化合物激素，通過(guò)與細(xì)胞膜表面特異的受體結(jié)合，進(jìn)而激活多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。血管緊張素II 受體有兩種亞型，血管緊張素II 1型受體和血管緊張素II 2 型受體，二者均為七次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員。血管緊張素II與血管緊張素II 1型受體結(jié)合可激活JAK/STAT 途徑和促分裂素原活化蛋白激酶（如細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶）。血管緊張素II 1型受體在血管重建和平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化過(guò)程中具有重要意

3、義，并且低氧可影響其在心肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中的分布。
　　 目前已有的研究表明，血管緊張素II 1型受體功能的實(shí)現(xiàn)與其在胞內(nèi)的運(yùn)輸密切相關(guān)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，血管緊張素II 1型受體經(jīng)過(guò)合成、折疊、裝配后，輸送到高爾基體進(jìn)行翻譯后的修飾，然后被輸送到細(xì)胞膜表面。目前針對(duì)血管緊張素II 1型受體如何從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)過(guò)高爾基體到達(dá)細(xì)胞表面的運(yùn)輸過(guò)程的研究較少。
　　 Rab蛋白，是GTPases的Ras 超家族成員之一，與胞內(nèi)蛋白在各

4、細(xì)胞器之間的運(yùn)輸有關(guān)。Rab Gtases 被命名為小G蛋白，屬于Ras 超家族，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有60多種Rab蛋白。Rab蛋白通過(guò)胞吐和胞吞的方式在囊泡運(yùn)輸中起重要作用，與其他Ras 超家族成員一樣，其功能通過(guò)與鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合時(shí)的分子轉(zhuǎn)位實(shí)現(xiàn)?；钚誀顟B(tài)下（與GTP結(jié)合時(shí)），Rab蛋白能通過(guò)特定的效應(yīng)器來(lái)介導(dǎo)囊泡運(yùn)輸。目前研究表明，Rab1分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，并介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至高爾基體的順向蛋白運(yùn)輸，Rab1可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞血管緊張

5、素II 1型受體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)高爾基體到細(xì)胞表面的表達(dá)。因此我們?cè)O(shè)想，可以通過(guò)調(diào)整Rab1介導(dǎo)的血管緊張素II 1型受體在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸，進(jìn)而調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化和其他活性。
　　 本實(shí)驗(yàn)主要研究低氧狀態(tài)下，Rab1對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞血管緊張素II 1型受體分布及功能的影響，并探討Rab1對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和其他功能的影響，為改善肺血管重建提供新的治療思路。
　　 研究?jī)?nèi)容：
　　 1.采

6、用肺內(nèi)動(dòng)脈組織貼塊法培養(yǎng)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，通過(guò)光鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞特征性的形態(tài)，并使用特異性的α-SMA抗體進(jìn)行免疫熒光染色鑒定。
　　 2.運(yùn)用飽和配體測(cè)定法測(cè)定大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞經(jīng)低氧處理后、慢病毒包裝的Rab1WT 或siRNA 轉(zhuǎn)染后血管緊張素II 1型受體在胞膜上的表達(dá)。
　　 3.使用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒包裝的Rab1WT和Rab1siRNA后的血管緊張素II 1型受體在細(xì)胞膜

7、和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分布狀況。
　　 4.采用Western Blot 檢測(cè)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒包裝的Rab1WT和Rab1siRNA后的血管平滑肌細(xì)胞標(biāo)志分子（α-SMA和VIM）的表達(dá)情況和STAT3 活性。
　　 5.細(xì)胞的增殖活性檢測(cè)采用MTS分析法，細(xì)胞加入CellTiter 96? Aqueous OneSolution Cell Proliferation Assay后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm的吸光度間接

8、反映細(xì)胞的增殖活性。
　　 結(jié)果：
　　 1.組織塊法培養(yǎng)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的鑒定結(jié)果顯示：相差顯微鏡下，原代培養(yǎng)的細(xì)胞呈梭狀，并呈峰-谷分布生長(zhǎng)，抗α-SMA抗體間接免疫熒光染色呈陽(yáng)性。
　　 2.正常對(duì)照組和低氧處理48 h后RPASMCs表面AT1R的表達(dá)量分別為556±61和725±83 cpm；常氧狀態(tài)下，對(duì)照組、轉(zhuǎn)染Rab1WT組和轉(zhuǎn)染Rab siRNA組RPASMCsAT1R的表達(dá)值分別為550±

9、69、804±130、301±46 cpm；低氧處理后，轉(zhuǎn)染Rab1WT后的細(xì)胞AT1R的表達(dá)值738±98 cpm，轉(zhuǎn)染Rab1siRNA后的細(xì)胞AT1R的表達(dá)值僅為371±68 cpm(P＜0.01)。
　　 3.轉(zhuǎn)染Rab1WT后，血管緊張素II 1型受體主要在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞膜上表達(dá)，而轉(zhuǎn)染Rab1siRNA后肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，血管緊張素II 1型受體主要積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
　　 4.低氧處理以及使用血管緊張素II

10、后，大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞STAT3 酪氨酸磷酸化水平增加5.37倍，而轉(zhuǎn)染Rab1siRNA 慢病毒后的細(xì)胞使用ZD7155（特異性的血管緊張素II 1型受體拮抗劑）后，其活性僅增加1.14倍（P<0.01）。
　　 5. 低氧處理以及使用血管緊張素II后，大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)志分子α-SMA和VIM 含量明顯減少，而轉(zhuǎn)染Rab1siRNA 慢病毒后的細(xì)胞經(jīng)ZD7155 處理，其表型標(biāo)志分子變化并不如此明顯（P<0.05）

11、。
　　 6.大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞經(jīng)低氧處理以及使用血管緊張素II后，代表其增殖活性的OD值較常氧對(duì)照組增加159％，而轉(zhuǎn)染Rab1siRNA 慢病毒后的細(xì)胞并使用ZD7155處理后，其OD值僅增加27％（P<0.01）。
　　 結(jié)論：
　　 1.Rab1蛋白可調(diào)節(jié)AT1R在大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的分布，其機(jī)制可能是通過(guò)影響AT1R在胞內(nèi)的囊泡運(yùn)輸。
　　 2.Rab1蛋白可調(diào)節(jié)AT1R 介導(dǎo)的JAK/ST