慢性糖皮質(zhì)激素對(duì)海馬神經(jīng)元NLRP-1炎癥小體的激活及BK通道的影響.pdf

1、糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoids，GCs)是腎上腺皮質(zhì)分泌的一種重要的激素，參與了機(jī)體多種物質(zhì)的代謝過(guò)程，對(duì)維持機(jī)體正常的生長(zhǎng)發(fā)育及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)等發(fā)揮重要的作用。同時(shí)糖皮質(zhì)激素還具有很強(qiáng)的抗炎、免疫抑制等重要的藥理作用，是臨床常用的藥物。另外，糖皮質(zhì)激素還是一種參與應(yīng)激的重要激素。然而大量研究顯示，長(zhǎng)期反復(fù)的應(yīng)激或大劑量外源性糖皮質(zhì)激素的給予可使體內(nèi)GCs維持在較高水平，引起海馬神經(jīng)元的丟失和死亡，與阿爾茨海默癥（AD）的發(fā)生

2、和發(fā)展密切相關(guān)。然而，體內(nèi)高水平的糖皮質(zhì)激素對(duì)海馬神經(jīng)元損傷的機(jī)制還尚不完全清楚。
　　第一部分：
　　目的：
　　研究慢性糖皮質(zhì)激素對(duì)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元NLRP-1炎癥小體激活的影響及機(jī)制，探討NLRP-1炎癥小體在慢性GCs誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷的作用。
　　方法：
　　1.原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元到第5天，隨機(jī)分成對(duì)照組和地塞米松（DEX，5μM）組，各組再分為1d、3d、5d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)。LDH試劑盒檢測(cè)海馬神

3、經(jīng)元細(xì)胞損傷情況；Hoechst33258染色測(cè)定海馬神經(jīng)元凋亡情況；Western blot檢測(cè)NLRP-1、ASC、Caspase-1、IL-1β的蛋白表達(dá)變化；ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-18的含量變化。
　　2.原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元到第5天，隨機(jī)分成6組：對(duì)照組，DEX(0.1,1,5μM)組，RU486(5μM)組和DEX(5μM)+RU486(5μM)組。LDH試劑盒檢測(cè)海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷情況；Hoech

4、st33258染色測(cè)定海馬神經(jīng)元凋亡情況；免疫熒光檢測(cè)GR和MAP2表達(dá)情況；Western blot檢測(cè)GR、ASC、NLRP-1、Caspase-1、IL-1β的蛋白表達(dá)變化；ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-18的含量變化；Q-PCR檢測(cè)NLRP-1、ASC、Caspase-1、IL-1β的mRNA表達(dá)變化情況。
　　結(jié)果：
　　1.與對(duì)照組比較，DEX5μM處理3、5d能明顯促進(jìn)海馬神經(jīng)元LDH的釋放；Ho

5、echst33258結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，DEX5μM處理1、3、5d能明顯促進(jìn)海馬神經(jīng)元凋亡，細(xì)胞核固縮或裂解呈碎塊狀；Western blot結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，DEX5μM處理5d的海馬神經(jīng)元細(xì)胞MAP2表達(dá)明顯下降，DEX5μM處理1、3d的海馬神經(jīng)元細(xì)胞NLRP-1, caspase-1 and IL-1β表達(dá)明顯增加。
　　2.與對(duì)照組比較，DEX1、5μM處理3d能明顯增加細(xì)胞上清液中LDH的含量，而RU486

6、可抑制其增加。Hoechst33258結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，DEX5μM處理3d導(dǎo)致海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡明顯。免疫熒光結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，DEX1μM和5μM處理5d海馬神經(jīng)元MAP2的表達(dá)明顯降低；DEX0.1,1和5μM處理3d能明顯減少海馬神經(jīng)元GR的表達(dá)。Western blot結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，DEX0.1,1和5μM處理3d能明顯減少海馬神經(jīng)元GR的表達(dá)以及明顯增加NLRP-1和ASC的表達(dá)；DEX0.1μM處理3

7、d能明顯減少海馬神經(jīng)元caspase-1和IL-1β的表達(dá)，DEX5μM處理3d的海馬神經(jīng)元caspase-1和IL-1β表達(dá)明顯增加；DEX1μM和5μM處理3d可明顯下調(diào)海馬神經(jīng)元NF-κB的表達(dá)；與DEX5μM組比較，RU486能明顯抑制DEX誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元caspase-1和IL-1β表達(dá)增高。ELISA結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，DEX1和5μM處理3d能明顯增加海馬神經(jīng)元細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-18的含量，而RU486能

8、明顯減少I(mǎi)L-1β和IL-18的釋放。
　　第二部分：
　　目的：
　　研究慢性糖皮質(zhì)激素對(duì)海馬神經(jīng)元 BK-NLRP1信號(hào)通路的影響，探討B(tài)K-NLRP1信號(hào)通路在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷中的作用，以便為AD的防治提供新的思路和靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1.原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元到第5天，隨機(jī)分成4組：對(duì)照組，DEX(5μM)組，Iberiotoxin(IbTx,0.2μM)組和DEX(5μM)+IbTx(

9、0.2μM)組。LDH試劑盒檢測(cè)海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷情況；Hoechst33258染色測(cè)定海馬神經(jīng)元凋亡情況；免疫熒光檢測(cè) MAP-2蛋白表達(dá)的變化；Western blot檢測(cè)MAP2、BK、NLRP-1、ASC、Caspase-1、IL-1β的蛋白表達(dá)變化；ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-18的含量變化；Q-PCR檢測(cè)NLRP-1、ASC、Caspase-1、IL-1β的 mRNA表達(dá)變化；采用離子選擇電極法檢測(cè)海馬神經(jīng)元

10、細(xì)胞內(nèi)鉀離子的濃度；全細(xì)胞膜片鉗方法觀察DEX和IbTx對(duì)海馬神經(jīng)元大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(large conductance calcium activated potassium channel channel, BK)電流變化的影響。
　　2.雄性小鼠分為對(duì)照組，DEX（5mg/kg）組，各組再分為7d、14d、21d、28d四個(gè)時(shí)點(diǎn)。Western blot和Q-PCR檢測(cè)小鼠海馬組織中BK mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　

11、　結(jié)果：
　　1.與對(duì)照組比較，IbTx能明顯減少 DEX誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元的 LDH釋放；IbTx也能抑制DEX誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元的凋亡。Western blot結(jié)果表明，與DEX5μM組比較，IbTx能明顯減少DEX誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元NLRP1, ASC, caspase-1和IL-1β的表達(dá)。免疫熒光結(jié)果顯示，與DEX5μM組比較，IbTx能明顯減少DEX誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元的MAP2的表達(dá)。ELISA結(jié)果表明，與DEX5μM組比較，IbTx

12、能明顯抑制海馬神經(jīng)元細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-18的釋放。全細(xì)胞膜片鉗結(jié)果顯示，DEX(5μM)可以增大海馬神經(jīng)元BK通道電流大小，降低細(xì)胞內(nèi)鉀離子的濃度，IbTx可抑制這一效應(yīng)。
　　2. Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，DEX5mg/kg處理7，21和28天小鼠海馬和皮層組織內(nèi) BK表達(dá)明顯增加。Q-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，DEX5mg/kg處理21天和28天小鼠皮層和海馬組織內(nèi)BK表達(dá)水平明顯增加。