GSAT與WTAP蛋白的克隆、表達(dá)純化以及初步晶體學(xué)分析.pdf

1、本文主要內(nèi)容如下：
　　1.GSAT的克隆,表達(dá)和純化以及初步晶體學(xué)分析
　　5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid,ALA)是四碳合成途徑當(dāng)中首要的供體,植物,藻類(lèi)和一些細(xì)菌也可以通過(guò)五碳途徑從谷氨酸合成5-氨基酮戊酸。在這個(gè)途徑中一系列的酶發(fā)揮著重要的作用,谷氨酸-1-半醛轉(zhuǎn)氨酶(Glutamate-1-semialdehyde aminotransferase,GSAT)是這個(gè)途徑的最后一個(gè)酶。其他

2、兩個(gè)重要的酶是谷氨酸-tRNA合成酶和谷氨酸-tRNA還原酶。谷氨酸-1-半醛轉(zhuǎn)氨酶在促使谷氨酸合成5-氨基酮戊酸過(guò)程中發(fā)揮最重要的作用。
　　我們從基因組文庫(kù)中克隆了GSAT的CDS序列,并構(gòu)建了GSAT-p28a質(zhì)粒。重組蛋白GSAT-HisTag在E.coli BL21(DE3)中表達(dá)量高,用Ni親和柱純化后純度達(dá)到95％以上。蛋白質(zhì)在濃縮和脫鹽過(guò)程中比較穩(wěn)定,動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)證實(shí)重組蛋白不存在多聚現(xiàn)象。用懸滴氣相擴(kuò)散法經(jīng)過(guò)篩

3、選和優(yōu)化得到了GSAT的結(jié)晶。X-Ray衍射表明晶體的衍射分辨率可達(dá)到2.0埃。完成了晶體衍射數(shù)據(jù)的收集,晶體空間群為C2,晶胞參數(shù)為a=111.428埃,b=56.469(?)埃,c=81.028埃,β=131.928°。分析計(jì)算和自旋patterson函數(shù)計(jì)算均表明,一個(gè)晶體學(xué)不對(duì)稱(chēng)單位含有一個(gè)蛋白質(zhì)分子。以Synechococcus的GSAT(3GSB)為結(jié)構(gòu)模型,用分子置換法已獲得結(jié)構(gòu)的初相位解析。結(jié)構(gòu)模型的精化過(guò)程正在進(jìn)行中。

4、
　　2.WTAP的克隆,表達(dá),純化和結(jié)構(gòu)研究
　　腎細(xì)胞腫瘤抑制基因WT1對(duì)于泌尿生殖系統(tǒng)的發(fā)育有很重要的作用。雖然很多目的蛋白基因已經(jīng)鑒別和一些WT1結(jié)合蛋白已經(jīng)獲得,但是對(duì)于WT1的作用機(jī)制還是沒(méi)有研究清楚。我們所研究的蛋白WTAP即腎細(xì)胞腫瘤抑制基因WT1相關(guān)蛋白,由于其特別的表達(dá)方式,因而可能表明其具有一些基本的細(xì)胞內(nèi)功能。由于WTAP是一個(gè)細(xì)胞核內(nèi)蛋白,和WT1基因一樣通過(guò)核質(zhì).雖然兩者之間的相互作用還沒(méi)有明確，

5、但是從現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，WTAP是一個(gè)具有重要意義的蛋白。
　　在WT1上有兩個(gè)可以選擇的剪切位點(diǎn)，一個(gè)是17個(gè)氨基酸，含有5個(gè)外顯子;第二個(gè)可以增加與刪除的是三個(gè)氨基酸(KTS)即賴氨酸，蘇氨酸和絲氨酸，存在于第9與第十個(gè)外顯子之間。根據(jù)著兩個(gè)位點(diǎn)的存在與否，WT1可以劃分為主要的四種異構(gòu)體。文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果表明，WT1發(fā)揮作用是必須與IYTAP相互結(jié)合。通過(guò)其序列分析，我們認(rèn)為這個(gè)結(jié)合位點(diǎn)應(yīng)該在N端，所以設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)而證明