基于微流體芯片的細(xì)胞操控關(guān)鍵技術(shù)研究.pdf

1、以細(xì)胞分離、篩選、捕獲、定位培養(yǎng)等技術(shù)為代表的細(xì)胞操控技術(shù)在體外診斷、基礎(chǔ)生物學(xué)等應(yīng)用與研究領(lǐng)域具有廣泛的需求和重要的價(jià)值。微流體技術(shù)對(duì)微小尺度上的流體及粒子、細(xì)胞等具有精確的操控能力，被廣泛應(yīng)用在多種細(xì)胞操控技術(shù)中。本論文以基于微流體芯片的細(xì)胞操控技術(shù)為研究對(duì)象，針對(duì)在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用和研究領(lǐng)域內(nèi)有重要意義的細(xì)胞分離和定位培養(yǎng)等關(guān)鍵操控技術(shù)，分別開展了矩形直通道中的細(xì)胞慣性匯聚、混合注射方式的慣性微流體細(xì)胞分離技術(shù)、基于慣性匯聚的細(xì)胞定量

2、分離與濃縮技術(shù)、結(jié)合捕獲微井和蛋白質(zhì)圖案的細(xì)胞定位培養(yǎng)技術(shù)、以及用于人體循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的微流體芯片的研究，以期為生物醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用提供細(xì)胞操控方面的微流體工具與研究平臺(tái)。本文的主要工作和創(chuàng)新點(diǎn)如下:
　　(1)對(duì)細(xì)胞在低深寬比矩形直通道中的慣性匯聚原理和規(guī)律進(jìn)行了研究，探究了粒子直徑、流速對(duì)匯聚質(zhì)量的影響，實(shí)現(xiàn)了粒子和Hep G2細(xì)胞在通道中的匯聚。在此基礎(chǔ)上，針對(duì)利用低深寬比矩形通道從高濃度、多種類混合細(xì)胞樣品中實(shí)現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞分

3、離的困難，以血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離為目標(biāo)，實(shí)現(xiàn)了一種采用混合注射方式的微流體細(xì)胞分離方法。該方法在利用慣性匯聚的同時(shí)，也利用了剪切致擴(kuò)散效應(yīng)及血液中的彈性力，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)細(xì)胞在低深寬比矩形直通道中的匯聚以及與高濃度血細(xì)胞的分離。利用該方法，通過(guò)對(duì)血液稀釋倍數(shù)、混合注射流速等因素的探索和優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了從全血或低倍稀釋血液中對(duì)目標(biāo)粒子或細(xì)胞的分離。芯片從全血中分離直徑18.7μm粒子的效率達(dá)到了82.5±10％，處理通量達(dá)到約5.6×108個(gè)

4、/分鐘;從2倍稀釋的血液中分離粒子的效率達(dá)到94.1±1.8％;從2倍稀釋的血液中分離Hep G2細(xì)胞的效率達(dá)到了90.8％±2.4％，處理通量達(dá)到約2.8×108個(gè)/分鐘。該方法具備直接從全血或低倍稀釋血液中分離目標(biāo)細(xì)胞的能力，同時(shí)具有較高的處理通量，在諸如人體血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離等應(yīng)用中有一定的實(shí)用價(jià)值。
　　(2)針對(duì)廣泛存的細(xì)胞定量濃縮需求，在慣性匯聚技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過(guò)定量調(diào)節(jié)出口通道的流阻比，實(shí)現(xiàn)了一種可對(duì)懸浮液中的

5、細(xì)胞進(jìn)行定量分離與濃縮的微流體芯片。利用熒光粒子，探究了出口系統(tǒng)流阻對(duì)粒子在通道中的運(yùn)動(dòng)軌跡及匯聚質(zhì)量的影響，并通過(guò)對(duì)出口通道的流阻比的調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)懸浮液中粒子或細(xì)胞濃度的定量調(diào)節(jié)。該芯片能夠?qū)^廣濃度范圍內(nèi)（10萬(wàn)個(gè)/毫升～180萬(wàn)個(gè)/毫升）的細(xì)胞懸浮液實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的定量濃縮，對(duì)細(xì)胞的活性檢測(cè)和后續(xù)培養(yǎng)結(jié)果表明細(xì)胞在濃縮過(guò)程中未受到可見的損傷。與傳統(tǒng)的基于離心機(jī)的細(xì)胞濃縮方法相比，該方法在懸浮液質(zhì)量、細(xì)胞丟失率、細(xì)胞損傷、處理時(shí)間、一致

6、性、人員操作要求等方面均體現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)，為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中廣泛存在的細(xì)胞定量濃縮需求提供了一種高效便捷的微流體技術(shù)。
　　(3)結(jié)合細(xì)胞捕獲微井和微接觸轉(zhuǎn)印技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了一種單細(xì)胞水平上的、無(wú)需對(duì)細(xì)胞施加物理和化學(xué)束縛的圖案化定位培養(yǎng)芯片。通過(guò)對(duì)微接觸轉(zhuǎn)印技術(shù)的工藝流程的優(yōu)化，成功在封閉的微流體通道中集成了空間上相互對(duì)準(zhǔn)的細(xì)胞捕獲微井和蛋白質(zhì)圖案。利用捕獲微井對(duì)細(xì)胞進(jìn)行捕獲，并在重力作用下將細(xì)胞釋放到蛋白質(zhì)圖案上，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞水

7、平上的細(xì)胞捕獲和圖案化培養(yǎng)。分別使用HeLa細(xì)胞和SGC-996細(xì)胞在芯片內(nèi)實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)達(dá)6天的圖案化定位培養(yǎng)，并對(duì)兩種細(xì)胞在芯片內(nèi)的貼壁、生長(zhǎng)、遷移、增殖等過(guò)程進(jìn)行了觀察與研究。該微流體芯片摒棄了傳統(tǒng)定位培養(yǎng)方法中存在的物理空間及化學(xué)成分上對(duì)細(xì)胞的束縛，提供了一種更為接近真實(shí)生長(zhǎng)條件的、單細(xì)胞水平上的圖案化細(xì)胞定位培養(yǎng)手段，在細(xì)胞遷移、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)培養(yǎng)、藥物篩選、單細(xì)胞分析、細(xì)胞間作用等研究與應(yīng)用領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用前景。
　　(4)實(shí)現(xiàn)