辣椒脈斑駁病毒文昌分離物全基因組序列分析和抗血清的制備.pdf

1、辣椒是一種重要的茄科類蔬菜作物,因其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富,特別是維生素C的含量在蔬菜中居第一位而深受人們喜愛。然而,近年來(lái),辣椒病毒病已成為辣椒生產(chǎn)發(fā)展的主要限制因素之一。辣椒脈斑駁病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是辣椒上主要的病毒病害之一,它的存在嚴(yán)重制約著世界各地的辣椒生產(chǎn),特別是韓國(guó)、馬來(lái)西亞、泰國(guó)、印度等國(guó)和臺(tái)灣等地區(qū),辣椒的種植面積與產(chǎn)量均明顯下降。辣椒脈斑駁病毒是一種(+)ssRNA病毒,為

2、馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)、馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)。盡管國(guó)內(nèi)外對(duì)Potyvirus屬的許多成員的基因組結(jié)構(gòu)和基因產(chǎn)物功能、以及病毒的株系分化和遺傳變異有了較深入的研究,但相比較而言,對(duì)于ChiVMV的這些方面的研究尚顯不夠。目前ChiVMV全基因組進(jìn)行克隆分析的報(bào)道不多,僅見報(bào)道的有印度與韓國(guó)兩個(gè)分離物,國(guó)內(nèi)還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。對(duì)其基因功能的研究也大都是與同屬其它成員進(jìn)行比對(duì)后推導(dǎo)得出的,而用分子生物學(xué)方法研究C

3、hiVMV株系分化和遺傳變異的報(bào)道更為鮮見。本文以文昌地區(qū)染病黃燈籠辣椒葉片的總RNA為模板,通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆了ChiVMV-WC分離物的全基因組序列,利用多種生物學(xué)軟件對(duì)該病毒的基因組全序列結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了分析和預(yù)測(cè),并確定它的分類地位;作者在ChiVMV-WC分離物的全基因組序列分析的基礎(chǔ)上對(duì)編碼基因CP進(jìn)行原核表達(dá)及制備特異性抗血清,為ChiVMV的檢測(cè)體系的建立打下基礎(chǔ)。本文獲得的主要結(jié)論如下:
　　 1.成功克隆

4、了ChiVMV-WC分離物全基因組序列,基因組全長(zhǎng)為9717 nt,包含一個(gè)長(zhǎng)9270 nt的單一開放閱讀框(ORF),編碼一個(gè)350.44 kDa的多聚蛋白。與其它馬鈴薯Y屬病毒一樣,多聚蛋白內(nèi)有9個(gè)推定的保守酶切位點(diǎn),切割產(chǎn)生10個(gè)成熟蛋白。
　　 2.ChiVMV-WC與報(bào)道的印度與韓國(guó)分離物(AJ237843和AJ972878)全基因組序列同源性分別為85.66％和93.54％,編碼多聚蛋白氨基酸序列同源性分別為89.8

5、4％和94.17％。通過(guò)與馬鈴薯Y病毒屬其他成員的多聚蛋白氨基酸序列比對(duì),我們確定ChiVMV-WC分離物為Potyvirus屬成員。CP和3'-UTR序列的相似性被認(rèn)為是Y屬病毒最重要的分類依據(jù),通過(guò)CP氨基酸和3'-UTR序列的比對(duì),我們認(rèn)為與ChiVMV-VN/C7越南分離物的親緣關(guān)系最近。
　　 3.根據(jù)所測(cè)的ChiVMV序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物,PCR擴(kuò)增出ChiVMV-WC分離物的CP基因,將其插入到Pet-30b(+)載體

6、中,然后將獲得的重組質(zhì)粒pET30b-ChiVMV CP轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)后,用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE分析,結(jié)果顯示CP基因高效表達(dá),主要以蛋白可溶性形式穩(wěn)定表達(dá)。通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)條件的優(yōu)化,確立了CP基因的表達(dá)條件:IPTG終濃度為0.1 mmol/L,誘導(dǎo)時(shí)間為2 h。
　　 4.用Ni2+-NTA瓊脂糖親和層析純化的融合蛋白免疫兔子并獲得抗血清。通過(guò)酶聯(lián)法(ID-ELISA)測(cè)定本實(shí)驗(yàn)制備的Ch