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1、目的:
　　酒精是一種常見的肝臟毒素，過量的酒精攝入可以導(dǎo)致酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)。ALD是一種逐漸進(jìn)展的肝臟疾病，包括酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver，AFL)、酒精性肝炎、肝纖維化及肝硬化等多種病理學(xué)表型。AFL是ALD早期出現(xiàn)的可逆階段，被視為對(duì)ALD進(jìn)行防治的最佳干預(yù)階段。細(xì)胞色素P4502E1(cytochrome P4502E1，CYP2E1)是CY

2、P450超家族的一員，也是微粒體乙醇氧化酶系統(tǒng)(microsomal ethanol-oxidizing system，MEOS)的主要成員;活化的CYP2E1可以產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)。已有研究證實(shí)了CYP2E1在慢性AFL發(fā)病中扮演著重要角色，其分子機(jī)制包括過氧化物酶體增殖物活化受體α(peroxisome proliferator-activatedreceptor-α，PPAR-

3、α)活性降低等因素。
　　酒精對(duì)肝臟的損傷受飲酒劑量和飲酒方式等多種因素的影響。Binge drinking是指短時(shí)間內(nèi)攝入大量酒精的飲酒方式，可以導(dǎo)致急性酒精性肝損傷如脂肪肝、肝炎和肝細(xì)胞壞死等。流行病學(xué)資料表明全球范圍內(nèi)binge drinking的發(fā)生率正在逐年增長(zhǎng)。以往關(guān)于AFL的研究多集中在慢性AFL，而binge drinking誘導(dǎo)的AFL卻較少地受到關(guān)注。在慢性AFL發(fā)病中起關(guān)鍵作用的CYP2E1是否是導(dǎo)致急性AF

4、L發(fā)病的關(guān)鍵因素？CYP2E1的抑制劑是否能夠拮抗binge drinking導(dǎo)致的急性肝損傷？這些問題仍待解答。
　　本研究擬建立binge drinking誘導(dǎo)的急性AFL小鼠模型，研究CYP2E1特異性抑制劑氯美噻唑(Chlormethiazole，CMZ)對(duì)急性AFL的拮抗作用，并從氧化應(yīng)激、線粒體損傷、肝臟脂肪合成分解代謝相關(guān)信號(hào)通路等方面進(jìn)行分子機(jī)制探討。
　　方法:
　　SPF級(jí)雄性昆明小鼠(18-22

5、g)30只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，隨機(jī)分成3組(n=10):對(duì)照組，模型組和CMZ/乙醇組。CMZ/Z醇組和模型組小鼠分別給予CMZ(50 mg/kg bw)和等體積的生理鹽水;2h后兩組小鼠通過灌胃給予3次5 g/kg bw乙醇（25％，w/v，兩次之間間隔12h）誘導(dǎo)急性AFL。對(duì)照組小鼠給予等體積無菌生理鹽水和等熱量/等體積的麥芽糖糊精溶液。末次酒精給予4小時(shí)后，摘眼球取血分離血清;隨后處死動(dòng)物，迅速分離肝臟，稱重后分割成小塊組織，分

6、別用于病理學(xué)檢測(cè)、生化指標(biāo)測(cè)定、western blotting及qRT-PCR分析。
　　通過H&E染色、蘇丹Ⅲ染色、油紅O染色和透射電鏡觀察肝臟組織病理學(xué)變化。通過生化測(cè)定試劑盒測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase, ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）、甘油三酯(triglyceride，TG)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘

7、肽(glutathione，GSH)和血清乙醇的含量;通過ELISA試劑盒測(cè)定腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和脂聯(lián)素的含量;通過western blotting和qRT-PCR技術(shù)測(cè)定PPAR-α、甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)、磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated prote

8、in kinase，AMPK)等調(diào)控脂肪代謝的分子蛋白和mRNA水平。
　　結(jié)果:
　　1.CMZ有效抑制了急性乙醇暴露導(dǎo)致的急性肝損傷:CMZ干預(yù)顯著抑制了急性乙醇暴露導(dǎo)致的血清轉(zhuǎn)氨酶活性的升高，血清和肝臟TG含量的增加。與模型組小鼠相比，CMZ干預(yù)組小鼠血清和肝臟TG含量分別下降了31.86％和52％(P＜0.05)。病理學(xué)檢查結(jié)果顯示模型組小鼠肝細(xì)胞中有大量脂肪滴蓄積;CMZ干預(yù)組小鼠脂肪滴明顯減少。
　　2.C

9、MZ顯著地抑制了急性乙醇暴露導(dǎo)致的小鼠肝臟中CYP2E1的活化和氧化應(yīng)激:與對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠肝臟中CYP2E1的蛋白含量以及肝臟MDA和4-HNE的含量均顯著增加（P＜0.05）;GSH的含量顯著降低（P＜0.05）。與模型組小鼠相比，CMZ干預(yù)組小鼠肝臟CYP2E1的蛋白含量和MDA的含量分別下降了28.94％和37.46％，GSH的含量增加了73.87％（P＜0.05）。免疫組化結(jié)果顯示，CMZ干預(yù)顯著地抑制了肝組織中4-

10、HNE的表達(dá)。
　　3.CMZ抑制了急性乙醇暴露導(dǎo)致的線粒體損傷:透射電鏡觀察結(jié)果顯示模型組小鼠肝細(xì)胞中有大量的脂肪滴;同時(shí)肝細(xì)胞線粒體發(fā)生了腫脹、破碎、溶解。CMZ干預(yù)顯著地抑制了乙醇導(dǎo)致的肝細(xì)胞中脂肪蓄積和線粒體損傷。
　　4.CMZ和急性乙醇暴露對(duì)PPAR-α信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)的影響:與對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠肝臟中PPAR-α，乙酰輔酶A氧化酶(acyl-CoA oxidase，ACOX)和脂肪酸結(jié)合蛋白(liv

11、er fatty acid-binding protein，LFABP)的mRNA水平分別下降了16.35％，29.39％，和25.97％（P＜0.05）;CMZ干預(yù)有效地抑制了PPAR-α和LFABP mRNA水平的降低（P＜0.05）。與對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠肝臟中PPAR-α，ACOX和LFABP的蛋白水平均顯著增加（P＜0.05）;CMZ干預(yù)抑制了PPAR-α和LFABP蛋白水平的增加(P＜0.05)。
　　5.CMZ

12、和急性乙醇暴露對(duì)AMPK和乙酰輔酶A羧化酶(acyl-CoAcarboxylase，ACC)蛋白水平及其磷酸化水平的影響:與對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠肝臟中AMPK、ACC、p-AMPK、p-ACC的蛋白水平均未發(fā)生顯著性的變化。與模型組小鼠相比，CMZ干預(yù)組小鼠肝臟中p-AMPK和p-ACC的蛋白水平略有下降(P＜0.05)。
　　6.CMZ干預(yù)對(duì)調(diào)控脂肪合成代謝關(guān)鍵分子的影響:SREBP-1c和脂肪酸合成酶（fatty aci

13、d synthase，F(xiàn)AS）以及二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶2(diacylglycerolacyltransferase2，DGAT2)的蛋白水平，以及SREBP-1c和FAS的mRNA水平均未受到CMZ干預(yù)或急性乙醇暴露的影響。
　　7.CMZ和急性乙醇暴露對(duì)肝細(xì)胞自噬活性的影響:與對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠肝臟的LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ比值顯著增加（P＜0.05）;p62蛋白水平顯著降低(P＜0.05)。與模型組小鼠相比，CMZ干預(yù)組

14、小鼠p62的蛋白水平進(jìn)一步下降（P＜0.05），LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值也略有下降（P＜0.05）。
　　8.CMZ和急性乙醇暴露對(duì)血清乙醇、TNF-α和脂聯(lián)素含量的影響:CMZ顯著抑制了急性乙醇暴露導(dǎo)致的血清脂聯(lián)素含量的降低;CMZ對(duì)血清乙醇含量無顯著影響;CMZ和急性乙醇暴露對(duì)血清TNF-α含量未見明顯影響。
　　結(jié)論:
　　1.CMZ能夠拮抗急性乙醇暴露導(dǎo)致的小鼠肝內(nèi)脂肪的蓄積。
　　2.CMZ可能通過抑制C