慢性免疫性血小板減少癥BAFF及BAFF受體相關(guān)發(fā)病機(jī)制研究.pdf

1、本研究旨在探討B(tài)細(xì)胞活化因子(BAFF)及其受體在慢性免疫性血小板減少癥(ITP)患者不同免疫器官（或組織）的表達(dá)情況和功能異常，從細(xì)胞和分子水平探討B(tài)AFF/BAFF受體系統(tǒng)在ITP發(fā)病中的作用，從而完善我們對(duì)于ITP發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并為ITP特異性免疫調(diào)節(jié)性治療提供可能的新思路。
　　第一部分慢性ITP患者BAFF體系的異常表達(dá)及其意義
　　目的：
　　檢測(cè)慢性ITP患者及缺鐵性貧血（IDA）患者骨髓上清sBAFF

2、及其受體在不同分化階段的B淋巴系細(xì)胞表面表達(dá)情況;研究BAFF受體在脾臟內(nèi)的分布情況并對(duì)比ITP脾切除患者和外傷致脾破裂(TSR)患者脾臟內(nèi)三種受體的表達(dá)差異，比較兩種患病人群脾臟不同發(fā)育階段B細(xì)胞表面三種BAFF受體的表達(dá)情況;分析外周血BAFF/BAFF受體系統(tǒng)在慢性ITP患者及健康對(duì)照不同淋巴細(xì)胞亞群中的表達(dá)差異。通過(guò)對(duì)比不同人群各淋巴器官BAFF體系的表達(dá)情況，總結(jié)慢性ITP患者體內(nèi)BAFF體系的表達(dá)特征，從而明確ITP患者體內(nèi)

3、BAFF/BAFF受體系統(tǒng)在淋巴細(xì)胞發(fā)育（免疫失耐受的建立）及血小板相關(guān)自身免疫應(yīng)答過(guò)程中的作用。
　　方法：
　　抽取36例慢性ITP患者及27例IDA患者骨髓，26例慢性ITP患者及22例健康對(duì)照外周血，分離血漿和單個(gè)核細(xì)胞。收集13例ITP脾切除患者及8例外傷致脾破裂行脾切手術(shù)患者的脾臟組織及脾臟單個(gè)核細(xì)胞。
　　酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunoadsorbent assay，ELISA

4、)檢測(cè)骨髓上清和外周血漿中BAFF和APRIL的濃度;實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)BAFF及BAFF受體mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。
　　改良單克隆抗體特異性俘獲血小板抗原(monoclonal antibodyimmobilization of platelet antigens，MAIPA)技術(shù)檢測(cè)

5、骨髓IgG、IgM型抗GPⅡ b/Ⅲa和GPⅠ b/Ⅺ自身抗體水平。
　　流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)骨髓、脾臟和外周血不同分化及發(fā)育階段B淋巴系細(xì)胞表面三種BAFF受體的表達(dá)情況。
　　免疫組織化學(xué)染色法（immunohistochemistry，IHC）和免疫熒光(immunofluorescence，IF)技術(shù)檢測(cè)脾臟BAFF受體的分布和表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.慢性ITP患

6、者骨髓、脾臟以及外周單個(gè)核細(xì)胞BAFF表達(dá)明顯增高.
　　2.三種BAFF受體在骨髓各發(fā)育階段B系淋巴細(xì)胞表面的異常表達(dá)。根據(jù)B淋巴系細(xì)胞在骨髓中的各個(gè)分化階段，將骨髓B淋巴系細(xì)胞分成B前細(xì)胞（包括祖B細(xì)胞和前B細(xì)胞）、B細(xì)胞以及漿細(xì)胞三個(gè)階段。流式結(jié)果統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn).
　　3.BAFF受體在ITP患者脾臟內(nèi)的異常表達(dá).
　　4.慢性ITP患者BAFF受體在外周血淋巴細(xì)胞亞群的異常表達(dá).
　　結(jié)論：
　　1.在慢

7、性ITP患者的骨髓中，BAFF和APRIL均參與了血小板相關(guān)自身免疫反應(yīng)，然而介導(dǎo)兩種細(xì)胞因子作用的受體有所不同，前者主要通過(guò)BCMA發(fā)揮作用，而后者通過(guò)TACI提高了漿細(xì)胞對(duì)自身抗血小板抗體的分泌。
　　2.ITP患者脾臟過(guò)度表達(dá)的BAFF與自身反應(yīng)性B細(xì)胞表面相應(yīng)的受體結(jié)合而協(xié)其免疫逃逸，是ITP患者B細(xì)胞免疫耐受失衡的重要機(jī)制之一。此外，ITP患者邊緣區(qū)B細(xì)胞BAFF-R表達(dá)顯著上調(diào)，能通過(guò)與該區(qū)非自身免疫性B淋巴細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性

8、結(jié)合BAFF而抑制自身的凋亡，這是ITP患者B淋巴細(xì)胞免疫耐受失衡的另一可能機(jī)制。
　　3.ITP患者外周血各淋巴細(xì)胞亞群表面BAFF-R表達(dá)顯著低于健康人群，可能與外周血血漿sBAFF水平明顯增高有關(guān)。
　　第二部分 BAFF/BAFF受體系統(tǒng)在ITP血小板特異性免疫反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用
　　研究目的：
　　為了進(jìn)一步探討三種BAFF受體在血小板免疫過(guò)程中扮演的各自角色，我們建立了一個(gè)血小板反應(yīng)性的體外培養(yǎng)體系，同

9、時(shí)利用特異性抗體對(duì)淋巴細(xì)胞表面的三種BAFF受體分別進(jìn)行功能性阻斷，從而進(jìn)一步研究BAFF及其受體在ITP血小板特異性免疫反應(yīng)中的作用。
　　方法：
　　分別采集33名慢性ITP患者及28名健康對(duì)照外周血CD14-單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMNCs)并其分為BAFF組、BAFF-R組、TACI組、BCMA組及對(duì)照組。各組分別加入不同BAFF受體阻斷抗體，從而對(duì)外周淋

10、巴細(xì)胞表面的BAFF受體進(jìn)行功能性阻斷。
　　負(fù)荷血小板抗原的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)的誘導(dǎo):免疫磁珠分選CD14+單核細(xì)胞，用重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage stimulating factor,rhGM-FSF;1000 U/mL)、重組人白細(xì)胞介素-4(recombinant humaninteleukin-

11、4，rhIL-4;1000 U/mL)以及自身過(guò)期血小板(1×106/mL)培養(yǎng)5天，培養(yǎng)后的未成熟DC培養(yǎng)體系加入重組人腫瘤壞死因子-α(recombinant human tumor necrosis factor-α,rhTNF-α;500 U/mL)培養(yǎng)2天以誘導(dǎo)成熟
　　建立血小板特異性混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocyte reaction，MLR)體系:負(fù)荷血小板抗原的成熟DCs與BAFF受體功能性阻斷后

12、的淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)(DCs: PBMNCs:1:10)。
　　流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry）檢測(cè)血小板特異性MLR體系中各淋巴細(xì)胞亞群的凋亡、增殖、活化以及轉(zhuǎn)化的情況;流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)培養(yǎng)后淋巴細(xì)胞各凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況。
　　體外培養(yǎng)血小板膜糖蛋白(glycoprotein，GP)Ⅱb/Ⅲa反應(yīng)性淋巴細(xì)

13、胞的擴(kuò)增:在重組人白細(xì)胞介素(recombinant human interleukin-2，rhIL-2;50 U/mL)的刺激下，外周單個(gè)核細(xì)胞與血小板Ⅱb/Ⅲa（10μg/mL）抗原共培養(yǎng)5天。
　　酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunoadsorbent assay，ELISA)檢測(cè)培養(yǎng)上清中BAFF、APRIL、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白細(xì)胞介素-2(interleukin

14、-2，IL-2)、IL-4、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)及腫瘤壞死因子-β1(tumor necrosisfactor-β，TNF-β1)濃度。
　　選取另外23名GPⅡb/Ⅲa自身抗體陽(yáng)性的慢性ITP患者以及20名健康對(duì)照，流式檢測(cè)其活化和未活化的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa反應(yīng)性淋巴細(xì)胞表面三種BAFF受體的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.

15、BAFF/BAFF-R信號(hào)通路對(duì)免疫效應(yīng)細(xì)胞的作用.
　　2.BAFF/TACI信號(hào)通路對(duì)T細(xì)胞功能的作用.
　　3活化的自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞表面BAFF受體顯著上調(diào).
　　結(jié)論：
　　1 B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞是主動(dòng)免疫應(yīng)答過(guò)程中主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞。BAFF/BAFF-R信號(hào)通路通過(guò)上調(diào)Bcl-2和Bcl-xL等抗凋亡基因的表達(dá)，抑制了B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的凋亡。同時(shí)，B細(xì)胞的增殖在該信號(hào)通路作用下明顯增強(qiáng)。<

16、br>　　2 BAFF/TACI信號(hào)通路主要對(duì)CD4+和CD8+兩種T細(xì)胞亞群的生物學(xué)行起作用。TACI與BAFF結(jié)合后不僅增強(qiáng)了CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的增殖，還促進(jìn)了兩種細(xì)胞亞群終末效應(yīng)型T細(xì)胞的轉(zhuǎn)化以及IL-4和IL-6的分泌。
　　3 BAFF不受體間功能可能存在之間或間接的拮抗或協(xié)同作用。
　　3.1 BAFF能有效促進(jìn)1型輔助性T細(xì)胞(T-helper type1，Th1)反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ的分泌，

17、而這種活化作用是在多各受體的協(xié)同作用下完成的，任何一種受體單獨(dú)作用均不能有效傳遞該促進(jìn)作用。
　　3.2 TACI能促進(jìn)2型輔助性T細(xì)胞(T-help type2，Th2)反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞因子IL-4、IL-6的分泌。但三種BAFF抗體共同作用時(shí)這種效應(yīng)被抑制。
　　4慢性ITP患者淋巴細(xì)胞的BAFF反應(yīng)性顯著增高
　　4.1在ITP患者，BAFF-R不僅介導(dǎo)BAFF對(duì)B細(xì)胞凋亡的抑制作用，還促進(jìn)B細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞的增

18、殖。TACI促進(jìn)ITP患者CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化以及IL-4、IL-6的分泌。而對(duì)于健康患者，BAFF僅通過(guò)BAFF-R的介導(dǎo)顯著降低B細(xì)胞的凋亡;對(duì)B細(xì)胞增殖以及T細(xì)胞的功能無(wú)顯著作用。這說(shuō)明慢性ITP患者淋巴細(xì)胞對(duì)BAFF的反應(yīng)性顯著高于健康人群。
　　4.2通過(guò)進(jìn)一步研究，我們發(fā)現(xiàn)ITP患者活化的GPⅡb/Ⅲa反應(yīng)性淋巴細(xì)胞表面BAFF-R或TACI表達(dá)較健康對(duì)照體內(nèi)自身反應(yīng)性細(xì)胞顯著上調(diào)可能是導(dǎo)致ITP患