抑制P38MAPK、mTORC1和AHR信號(hào)促進(jìn)人臍帶血HSCs擴(kuò)增并維持干性.pdf

1、第一部分抑制臍帶血CD34+細(xì)胞體外擴(kuò)增過程中P38 MAPK和mTORC1信號(hào)降低細(xì)胞衰老水平
　　背景：造血干細(xì)胞移植（HSCT）是一種有效的治療造血系統(tǒng)疾病的方法。但由于造血干細(xì)胞（HSCs）數(shù)量不足，嚴(yán)重阻礙了 HSCT在臨床中的應(yīng)用。盡管臨床上對(duì)臍帶血HSCT的研究表明，臍帶血HSCs在體外擴(kuò)增兩倍即可滿足臨床治療的需求，但問題是傳統(tǒng)利用組合細(xì)胞因子或飼養(yǎng)層細(xì)胞擴(kuò)增HSCs的方法很難得到具有長(zhǎng)期造血重建能力的HSCs。造

2、血重建能力是衡量 HSCs在植入受者體內(nèi)后重建骨髓造血情況的指標(biāo)。因此，在擴(kuò)增HSCs的同時(shí)維持干細(xì)胞的自我更新、多譜系分化、相對(duì)靜止等干細(xì)胞性質(zhì)，即維持干細(xì)胞的干性（stemness）成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。
　　HSCs的發(fā)育經(jīng)歷增殖、分化、衰老，最終走向死亡，因此可以通過調(diào)控 HSCs的增殖、分化、衰老以及死亡過程從而達(dá)到促進(jìn)其在體外擴(kuò)增的目的。β-半乳糖苷酶是衰老細(xì)胞的一種生物學(xué)標(biāo)志，其在細(xì)胞中活性增高意味著細(xì)胞衰老發(fā)生。衰老

3、的HSC雖具有代謝活性，但喪失了干細(xì)胞的自我更新和多系分化潛能。我們之前的研究表明，抑制過度活化的P38 MAPK或mTORC1信號(hào)可以降低擴(kuò)增后細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶的活性，通過抑制細(xì)胞衰老促進(jìn)HSCs在體外擴(kuò)增，并增強(qiáng)擴(kuò)增后細(xì)胞的造血重建能力。鑒于抑制活化的P38 MAPK或mTORC1信號(hào)均可以抑制細(xì)胞衰老，我們期望同時(shí)抑制活化的P38 MAPK和mTORC1信號(hào)能進(jìn)一步抑制細(xì)胞衰老，促進(jìn)HSCs在體外擴(kuò)增，同時(shí)增加HSCs的造血重

4、建能力。
　　方法：我們?nèi)〗】诞a(chǎn)婦的臍帶靜脈血，利用磁珠分選的方法分離臍帶血CD34+細(xì)胞。利用細(xì)胞因子IL-6、TPO、SCF和Flt3-Ligand擴(kuò)增臍帶血CD34+細(xì)胞，同時(shí)利用LY2228820和（或）Rapamycin抑制細(xì)胞體外擴(kuò)增過程中活化的P38 MAPK和（或）mTORC1信號(hào)。在擴(kuò)增后，我們利用western blot或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)P38 MAPK和mTORC1信號(hào)通路中重要的信號(hào)分子p-P38、p-

5、P70 S6、p-4E BP1或 p-mTOR的表達(dá)。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)擴(kuò)增后細(xì)胞表面 CD34、CD38、CD90、CD45RA分子的表達(dá)。同時(shí)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞增殖、周期、凋亡和衰老情況。另外，我們還通過克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了擴(kuò)增后的細(xì)胞形成克隆形成單位（CFU）的數(shù)量，其代表造血祖細(xì)胞的數(shù)量。
　　結(jié)果：我們的結(jié)果顯示臍帶血 CD34+細(xì)胞在體外擴(kuò)增培養(yǎng)過程中 P38 MAPK和mTORC1信號(hào)均被活化，LY2228820

6、和Rapamycin可以有效抑制活化的P38 MAPK和mTORC1信號(hào)。與單獨(dú)使用LY2228820或Rapamycin相比，同時(shí)使用LY2228820和 Rapamycin增加了臍帶血 CD34+細(xì)胞在體外擴(kuò)增后 CD34+、CD34+CD38–、CD34+CD45RA–表型造血干/祖細(xì)胞在總細(xì)胞中的比例。但是，由于Rapamycin的使用導(dǎo)致總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)減少，以至于聯(lián)合使用LY2228820和Rapamycin并沒有增加表型造血

7、干/祖細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)。另外，克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，與單獨(dú)使用LY2228820或Rapamycin相比，聯(lián)合使用LY2228820和Rapamycin沒有增加CFU-E、CFU-GM、CFU-M、CFU-GEMM和總的CFU數(shù)量，代表其并沒有促進(jìn)紅細(xì)胞祖細(xì)胞、粒-巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞、多潛能粒-紅-巨噬-巨核細(xì)胞祖細(xì)胞以及總的祖細(xì)胞擴(kuò)增或沒有抑制造血祖細(xì)胞分化。我們分析 Rapamycin導(dǎo)致總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)減少的原因發(fā)現(xiàn)，Rapamycin

8、抑制了細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，但不影響細(xì)胞凋亡。對(duì)細(xì)胞衰老水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用LY2228820或Rapamycin均可以降低細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶的活性，提示其抑制細(xì)胞衰老；當(dāng)同時(shí)使用LY2228820和Rapamycin時(shí)細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶的活性進(jìn)一步降低，代表細(xì)胞衰老水平進(jìn)一步降低。
　　結(jié)論：抑制臍帶血CD34+細(xì)胞體外擴(kuò)增過程中活化的P38 MAPK和mTORC1信號(hào)通過抑制細(xì)胞衰老增加了擴(kuò)增后表型造血

9、干/祖細(xì)胞在總細(xì)胞中的比例。
　　第二部分同時(shí)抑制細(xì)胞衰老和AHR信號(hào)促進(jìn)臍帶血造血干細(xì)胞擴(kuò)增
　　背景：我們前一部分的研究結(jié)果顯示，臍帶血來源的CD34+細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中P38 MAPK和mTORC1信號(hào)均被活化，共抑制活化的P38 MAPK和mTORC1信號(hào)通過降低細(xì)胞的衰老水平增加擴(kuò)增后表型造血干/祖細(xì)胞在總細(xì)胞中的比例，但并沒有促進(jìn)表型造血干/祖細(xì)胞的擴(kuò)增，我們分析其可能促進(jìn)了HSC干性的維持。近年來研究發(fā)現(xiàn)，使

10、用SR1抑制芳香烴受體（AHR）可以抑制HSCs在體外擴(kuò)增培養(yǎng)過程中細(xì)胞的分化，促進(jìn)HSCs在體外擴(kuò)增。對(duì)敲除AhR基因的小鼠HSCs研究發(fā)現(xiàn)，雖然敲除AhR基因可以增加小鼠骨髓中表型造血干/祖細(xì)胞的數(shù)量，但同時(shí)也導(dǎo)致HSC喪失了自我更新能力。我們假設(shè)SR1抑制AHR信號(hào)促進(jìn)HSCs擴(kuò)增的同時(shí)也誘發(fā)了細(xì)胞衰老，那么在使用SR1抑制細(xì)胞分化的基礎(chǔ)上同時(shí)抑制細(xì)胞衰老可能會(huì)進(jìn)一步增加擴(kuò)增后細(xì)胞的造血重建能力。
　　本研究中我們期望通過調(diào)

11、控細(xì)胞衰老和分化進(jìn)一步促進(jìn)HSCs擴(kuò)增，增加擴(kuò)增后細(xì)胞的造血重建能力。因此，我們?cè)谇耙徊糠帜殠а狢D34+細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)上加入了抑制分化的小分子物質(zhì)SR1，以期通過抑制細(xì)胞衰老和分化達(dá)到進(jìn)一步促進(jìn)HSCs在體外擴(kuò)增和增加體內(nèi)移植效率的目的。
　　方法：按前一部分?jǐn)U增臍帶血CD34+細(xì)胞的方法擴(kuò)增細(xì)胞，在前期抑制P38 MAPK和mTORC1的基礎(chǔ)上加入SR1抑制AHR信號(hào)，同時(shí)設(shè)對(duì)照組、抑制P38 MAPK和mTORC1組和單獨(dú)使用

12、SR1組。擴(kuò)增后，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)p-P38、p-mTOR和CYP1B1分子的表達(dá)；檢測(cè)擴(kuò)增后細(xì)胞表面CD34、CD38、CD90和CD45RA分子的表達(dá)；檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡和衰老情況。通過克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)擴(kuò)增后 CFU的形成。選擇重度免疫缺陷 NOD-Prkdcscid Il2rgnull小鼠作為移植受者，未擴(kuò)增的或擴(kuò)增后的細(xì)胞通過小鼠尾靜脈移植入小鼠體內(nèi)。在移植后第1、4、8周檢測(cè)小鼠血液中人源性細(xì)胞嵌合率，在移植后第13周

13、檢測(cè)小鼠骨髓和脾臟中人源性細(xì)胞嵌合率，同時(shí)檢測(cè)小鼠骨髓中人源性 T、B淋巴細(xì)胞、髓細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞、NK細(xì)胞以及造血干/祖細(xì)胞占總的人源性細(xì)胞的比例。
　　結(jié)果：我們的結(jié)果顯示，使用LY2228820、Rapamycin和SR1可以分別抑制臍帶血CD34+細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中活化的P38 MAPK、mTORC1和AHR信號(hào)。與抑制P38 MAPK和 mTORC1信號(hào)或單獨(dú)抑制 AHR信號(hào)相比，共抑制活化的P38 MAPK、mT

14、ORC1和 AHR信號(hào)明顯增加了擴(kuò)增后 CD34+、CD34+CD38–、CD34+CD90+、CD34+CD45RA–細(xì)胞在總細(xì)胞中的比例，促進(jìn)了代表造血干細(xì)胞和多潛能造血祖細(xì)胞的CD34+CD45RA–細(xì)胞擴(kuò)增。克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，相對(duì)于抑制活化的P38 MAPK和mTORC1信號(hào)，共抑制活化的P38 MAPK、mTORC1和AHR信號(hào)或單獨(dú)抑制AHR信號(hào)增加了CFU-GM、CFU-GEMM和總CFU的數(shù)量，提示我們共抑制活化的

15、P38 MAPK、mTORC1和AHR信號(hào)或單獨(dú)抑制AHR信號(hào)促進(jìn)了造血祖細(xì)胞擴(kuò)增或抑制了造血祖細(xì)胞的分化。我們對(duì)其機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，共抑制活化的P38 MAPK、mTORC1和AHR信號(hào)通過降低擴(kuò)增后細(xì)胞的分化和衰老水平從而促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞擴(kuò)增。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，與未擴(kuò)增的細(xì)胞或?qū)φ战M相比，抑制活化的P38 MAPK和 mTORC1信號(hào)或單獨(dú)抑制 AHR信號(hào)增加擴(kuò)增后細(xì)胞在小鼠血液和骨髓中的植入率；與抑制活化的P38 MAPK和mT