田菁根瘤菌中烷基氫過氧化物酶在抗氧化壓力及共生固氮中的生理作用.pdf

1、根瘤菌與豆科植物能夠共生形成根瘤進行固氮，在相互作用過程中植物會產(chǎn)生防御反應，會產(chǎn)生一部分活性氧物質(zhì)ROS(reactive oxygen specie)來阻抗細菌的侵入。植物進行光合作用會使得體內(nèi)氧化壓力升高，根瘤菌為了在宿主體內(nèi)定殖必須要適應植物體內(nèi)氧化壓力的變化，因此會產(chǎn)生一些過氧化物酶來進行代謝。此外共生固氮是厭氧反應，因此過氧化物酶的產(chǎn)生對根瘤菌與豆科植物的共生過程起到非常重要的作用。田菁固氮根瘤菌(Azorhizobium

2、caulinodans ORS571)與宿主毛萼田菁既可以形成根瘤，同時又可以形成莖瘤。莖瘤完全暴露在空氣中，且其皮層中含有能進行光合作用放氧的葉綠體，因此莖瘤中的類菌體更易受到活性氧物質(zhì)的危害。因此研究A.caulinodans ORS571對過氧化物的抗性機制十分重要。
　　在根瘤菌中，過氧化氫酶可以清除共生過程中產(chǎn)生的ROS，并將過氧化氫轉(zhuǎn)化成水和氧。在本研究中通過生物信息學分析確定了azc1050和azc1350分別編碼A

3、.caulinodans ORS571中烷基氫過氧化物酶(AhpC)和烷基氫過氧化物酶家族蛋白(Bcp)。首先利用同源重組的方法對這兩個基因進行了框內(nèi)缺失，在體外模擬體內(nèi)環(huán)境進行了敏感性實驗，實驗中ahpC和bcp缺失株對有機氫過氧化物類的物質(zhì)不是特別敏感，它們分別是異丙苯氫過氧化物(CuOOH)和叔丁基氫過氧化物(tBOOH)，但對過氧化氫(H2O2)表現(xiàn)出較強的敏感性。這表明在所研究的三種過氧化物中，aHpC、bcp對H2O2的清除

4、能力強于有機氫過氧化物類。據(jù)報道，在大腸桿菌中，ahpC、bcp的缺失株對過氧化氫以及有機氫都表現(xiàn)出一定的敏感性。此外，在大部分細菌中，這整個過程都受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白OxyR的調(diào)控，OxyR是屬于LysR家族的調(diào)控蛋白。據(jù)了解oxyR可以激活或者抑制oxyR調(diào)節(jié)子的表達，包括ahpCF, katG，gorA，grxA，trxC,dps，并且在大腸桿菌Escherichia coli和銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginos

5、a中AhpC受到OxyR的正調(diào)控。于是構建了ahpC的翻譯融合表達載體，發(fā)現(xiàn)基因oxyR缺失后對ahpC的表達量沒有顯著影響。且加入過氧化氫誘導兩小時后再次測定lacZ活性，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與不加過氧化氫時活性一致，即oxyR對ahpC沒有調(diào)控關系，并且過氧化氫對其不起誘導作用。可以認為在田菁根瘤菌中ahpC是低水平的組成型表達。根據(jù)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)ahpC對有機氫過氧化物敏感，而ohr是細胞內(nèi)特異性的清除有機氫過氧化物類的過氧化物酶，且能夠被Cu

6、OOH誘導，因此本文還研究了兩者在清除CuOOH功能上是否存在功能互補關系，結(jié)果證明ohr在缺失株ahpC中的表達量升高約1.5倍，CuOOH誘導后表達量升高2倍，因此兩者在功能上著實有互補關系。
　　此外，本文還研究了ahpC和bcp對A.caulinodans ORS571與毛萼田菁結(jié)瘤以及共生固氮的影響。由于細菌在侵染豆科植物時，豆科植物的根部會發(fā)生根毛卷曲，因此我們進行了根毛吸附實驗，研究結(jié)果表明ahpC和bcp的缺失菌株