PCV2通過激活MyD88-NF-κB信號途徑調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)仔豬淋巴細(xì)胞IL-4和IL-12的分泌.pdf

1、研究豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus2，PCV2）對仔豬淋巴細(xì)胞分泌IL-4和IL-12動(dòng)態(tài)影響及其調(diào)控的信號途徑，旨在進(jìn)一步了解PCV2引起仔豬免疫抑制的機(jī)制及防治PCVD的新策略。
　　選取8頭PCV2和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV）血清抗原、抗體均為陰性的普通斷奶仔豬，無菌取其脾臟制成單細(xì)胞懸液后，

2、隨機(jī)分為4組:對照組、NF-κB抑制劑組（抑制劑組）、PCV2組和NF-κB抑制劑-PCV2組（抑制劑-PCV2組），進(jìn)行體外培養(yǎng)，并于0、6、12、24和48 h收獲懸浮的淋巴細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清液。間接免疫熒光法(IFA)定位檢測PCV2感染淋巴細(xì)胞的情況和核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)入核情況;流式細(xì)胞儀定量檢測PCV2感染淋巴細(xì)胞比例;利用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4、IL-10

3、和IL-12的蛋白含量;Western blot定量檢測細(xì)胞核中NF-κB/p65，細(xì)胞漿中髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor88，MyD88）、磷酸化抑制性κB（phosphorylated IκB，p-IκB）、NF-κB/p65蛋白含量的變化;電泳遷移率法（electrophoretic mobility shifft assay，EMSA）檢測細(xì)胞核中NF-κB與DNA的結(jié)合率。分析I

4、L-4、IL-10和IL-12含量的變化與MyD88-NF-κB信號途徑的關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果顯示:IFA定位檢測顯示PCV2感染6h后可在淋巴細(xì)胞內(nèi)觀察到PCV2抗原，并主要存在細(xì)胞漿;流式細(xì)胞定量檢測結(jié)果，PCV2對淋巴細(xì)胞的感染率隨時(shí)間而增加，感染后6h為1.19％，到48 h達(dá)17.48％。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4含量，PCV2組低于對照組及抑制劑-PCV2組，且在12h、24 h、48 h差異顯著(P＜0.05)，對照組與抑制劑-P

5、CV2組無差異。感染12 h后PCV2組IL-10含量顯著高于對照組(P＜0.05);且抑制劑-PCV2組上清液中IL-10含量與PCV2組并無差異。PCV2組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-12含量，6h、12h、24 h顯著高于同時(shí)間對照組(P＜0.05);抑制劑-PCV2組顯著或極顯著低于PCV2組(P＜0.05或P＜0.01)。PCV2感染后，淋巴細(xì)胞胞漿內(nèi)MyD88的蛋白含量均顯著高于同時(shí)間對照組（P＜0.01或P＜0.05）;PCV2

6、組與抑制劑-PCV2組之間無顯著差異。PCV2組淋巴細(xì)胞胞漿內(nèi)p-Iκ Bα的蛋白含量，24 h時(shí)顯著高于對照組（P＜0.05），48 h極顯著升高（P＜0.01）;抑制劑-PCV2組從6h開始極顯著低于PCV2組(P＜0.01)。IFA法定位檢測NF-κB/p65入核情況，攻毒后6 h PCV2組淋巴細(xì)胞胞核內(nèi)可觀察到NF-κB/p65蛋白核易位并隨時(shí)間增加。蛋白定量結(jié)果表明，PCV2組淋巴細(xì)胞胞漿中NF-κB/p65含量逐漸降低，從

7、12h開始均顯著低于對照組(P＜0.05);對照組、抑制劑組、抑制劑-PCV2組之間無顯著差異。感染后胞核中NF-κB/p65含量逐漸增加，6h到48 h每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均極顯著高于對照組(P＜0.01);抑制劑-PCV2組均極顯著低于PCV2組（P＜0.01或P＜0.05）。EMSA試驗(yàn)結(jié)果表明，感染后12h、48 h，PCV2組淋巴細(xì)胞胞核中NF-κB與DNA的結(jié)合率極顯著高于對照組(P＜0.01)，24 h與對照組相比結(jié)合率顯著增加（P