轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1-結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(TGF-β1-CTGF)信號(hào)軸介導(dǎo)膠質(zhì)瘤替莫唑胺化療耐藥機(jī)制研究.pdf

1、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma，GB)為顱內(nèi)最常見(jiàn)原發(fā)性惡性腫瘤，盡管目前以手術(shù)聯(lián)合放化療的綜合治療方法已成為指南，但GB患者預(yù)后仍未改善，術(shù)后極易復(fù)發(fā)。替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)是目前GB治療一線化療藥，但TMZ耐藥是制約膠質(zhì)瘤化療療效并導(dǎo)致治療失敗的重要原因。
　　既往研究顯示結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(Connective Tissue Growth Factor，CTGF)差異表達(dá)與腫瘤耐藥存在相關(guān)性，然而

2、其在膠質(zhì)瘤TMZ耐藥中具體調(diào)控機(jī)制尚不明確。本研究擬深入探討CTGF介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤TMZ耐藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以期豐富膠質(zhì)瘤耐藥分子調(diào)控機(jī)制，為膠質(zhì)瘤TMZ耐藥機(jī)制闡明及臨床逆轉(zhuǎn)提供依據(jù)。
　　目的：
　　明確CTGF在膠質(zhì)瘤TMZ耐藥進(jìn)程中所扮演的角色;證實(shí)CTGF可通過(guò)干性獲取調(diào)制膠質(zhì)瘤細(xì)胞TMZ耐藥;并深入闡明TGF-β信號(hào)激活促進(jìn)CTGF表達(dá)介導(dǎo)膠質(zhì)瘤TMZ耐藥的分子調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　采用免疫組化、qRT

3、-PCR等分析CTGF表達(dá)與膠質(zhì)瘤耐藥的相關(guān)性;應(yīng)用慢病毒干擾或過(guò)表達(dá)等功能性研究CTGF表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤TMZ耐藥的影響;通過(guò)腫瘤球形成、流式細(xì)胞術(shù)等探討CTGF與腫瘤干性表達(dá)的相關(guān)性;運(yùn)用ELISA、Western blot等深入闡明TGF-β信號(hào)激活促進(jìn)CTGF表達(dá)介導(dǎo)膠質(zhì)瘤TMZ耐藥分子機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1)藥物敏感性分析發(fā)現(xiàn)，體外構(gòu)建的膠質(zhì)瘤TMZ耐藥細(xì)胞IC50在1.5-2.0mM間，其耐藥性顯著高于親本細(xì)胞(

4、1.0mM);qRT-PCR、Western blot檢測(cè)提示，膠質(zhì)瘤TMZ耐藥細(xì)胞顯著高表達(dá)ABCB1、ABCC、BCRP及MGMT耐藥相關(guān)表型基因與蛋白。
　　2)耐藥細(xì)胞基因芯片分析與篩選發(fā)現(xiàn)，CTGF在膠質(zhì)瘤TMZ耐藥細(xì)胞中差異高表達(dá)（上調(diào)9.14倍）;臨床膠質(zhì)瘤組織樣本檢測(cè)證實(shí)CTGF表達(dá)與膠質(zhì)瘤惡性分級(jí)、腫瘤耐藥性呈正相關(guān)關(guān)系。
　　3)TMZ處理促進(jìn)體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞CTGF mRNA與蛋白表達(dá)，且具有明顯的時(shí)間與

5、濃度依賴。
　　4)干擾CTGF抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆形成能力，提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ化療敏感性，增強(qiáng)TMZ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡蛋白C-PARP表達(dá);裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干擾CTGF抑制體內(nèi)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)及腫瘤形成。
　　5)過(guò)表達(dá)CTGF增強(qiáng)并回復(fù)TMZ預(yù)處理后膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆形成能力，下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ化療敏感性，并降低TMZ凋亡誘導(dǎo);過(guò)表達(dá)CTGF促進(jìn)裸鼠皮下成瘤，下調(diào)C-PARP表達(dá)，增強(qiáng)膠質(zhì)瘤對(duì)TMZ化療耐藥。
　　6

6、)CTGF上調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞腫瘤干性基因ALDH1、CD44、Nestin、Nanog的表達(dá)，增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞腫瘤球形成能力，促進(jìn)CD44+細(xì)胞表達(dá)與蛋白表達(dá);siCD44共轉(zhuǎn)染分析發(fā)現(xiàn)，干擾CD44抑制過(guò)表達(dá)CTGF膠質(zhì)瘤細(xì)胞腫瘤球形成能力，逆轉(zhuǎn)CTGF介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤TMZ耐藥性。
　　7)ELISA與qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示TMZ促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞TGF-β1表達(dá)上調(diào)，且具有一定的濃度依賴;免疫熒光提示TGF-β1與CTGF存在共表達(dá)關(guān)

7、系;聯(lián)合TGF-β中和抗體或抑制劑SB431542逆轉(zhuǎn)TMZ誘導(dǎo)的CTGF表達(dá)上調(diào)，而加入rTGF-β1因子促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞CTGF蛋白表達(dá)。
　　8)TMZ促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞Smad3與ERK1/2蛋白磷酸化;瞬時(shí)干擾Smad3與ERK1/2下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞CTGF蛋白表達(dá)，同時(shí)逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)CTGF引起的TMZ耐藥;裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)膠質(zhì)瘤化療過(guò)程中TMZ促進(jìn)膠質(zhì)瘤耐藥性產(chǎn)生，且與TGF-β1-Smad3/ERK1/2-CTGF信號(hào)通路

8、激活密切相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1)耐藥細(xì)胞模型與臨床組織樣本證實(shí)CTGF與膠質(zhì)瘤耐藥密切相關(guān)。
　　2)體外TMZ處理促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞CTGF表達(dá);下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞CTGF表達(dá)促進(jìn)TMZ化療增敏與細(xì)胞凋亡;而過(guò)表達(dá)CTGF促進(jìn)膠質(zhì)瘤TMZ化療耐藥，細(xì)胞凋亡調(diào)制參與了這一過(guò)程。
　　3)CTGF促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞腫瘤干性表達(dá)，靶向腫瘤干性調(diào)制CTGF介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤TMZ耐藥性改變。
　　4)TGF-β1信號(hào)激活促進(jìn)T