家蠶VB6代謝中兩個(gè)關(guān)鍵酶cDNA克隆、原核表達(dá)、酶學(xué)鑒定及基因結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、維生素B6是一類化合物的總稱，包括吡哆醇(Pyridoxine，PN)、吡哆胺(Pyridoxine，PM)、吡哆醛(Pyfidoxal，PL)，及三者相應(yīng)的磷酸酯形式，磷酸吡哆醇(Pyridoxine-5’-phosphate，PNP)、磷酸吡哆胺(Pyridoxine-5’-phosphate，PMP)、磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate，PLP)。PLP是細(xì)胞中一百多種酶的輔酶，這些酶大多涉及氨基酸代謝中的催

2、化過程。同時(shí)PLP還與細(xì)胞其他多種生理活動(dòng)相關(guān)，在細(xì)胞中具有很多重要功能。植物和許多微生物能夠從小分子代謝物從頭合成PLP供機(jī)體需要。自然界中存在兩種PLP從頭合成途徑，一種與PdxA及PdxJ相關(guān)，另一種與PDX1及PDX2相關(guān)。哺乳動(dòng)物中沒有PLP從頭合成途徑，需從食物中獲得VB6前體(PN、PL、PM)通過補(bǔ)救合成途徑來合成PLP。實(shí)際上，在細(xì)菌和真核生物細(xì)胞中都普遍存在一條相似的合成PLP的補(bǔ)救途徑。這條補(bǔ)救代謝途徑涉及不同VB

3、6化合物間的相互轉(zhuǎn)變，吡哆醛激酶(Pyridoxal kinase，PLK)、磷酸毗哆醇氧化酶(Pyridoxine 5’-phosphate oxidase，PNPO)及VB6磷酸酶在此條途徑中起主要作用。在Zn<'2+>和ATP存在下，PLK催化PN、PM、PL的各自磷酸化反應(yīng)，生成PNP、PMP、PLP。在FMN和O<,2.存在下，PNPO催化PNP或PMP的氧化反應(yīng)，生成PLP。 家蠶和哺乳動(dòng)物一樣，不能夠自身從頭合成P

4、LP，需要食物中的VB6前體來合成PLP。家蠶VB6代謝方式與哺乳動(dòng)物相比存在較大差異。家蠶體內(nèi)蛋白周轉(zhuǎn)率高，短期內(nèi)可合成大量蛋白質(zhì)。維持體內(nèi)PLP濃度的動(dòng)態(tài)平衡的需求在家蠶中更突出。因此，家蠶中PLK和PNPO的酶活性調(diào)節(jié)也將更明顯。編碼PLK和PNPO的cDNA或基因已從哺乳動(dòng)物、植物和幾種微生物中鑒定出來。昆蟲中未見有克隆PLK及PNPO的報(bào)道。 本研究中，利用家蠶基因組數(shù)據(jù)庫及EST 庫，通過生物信息學(xué)方法獲得了假定的編

5、碼家蠶PLK和PNPO的cDNA。依據(jù)假定的cDNA序列設(shè)計(jì)跨編碼區(qū)的引物，使用設(shè)計(jì)的引物及以家蠶脂肪體總cDNA為模板，通過RT-PCR方法分別擴(kuò)增到預(yù)期的兩條DNA片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆后測(cè)序，序列結(jié)果提交至GenBank，其登錄號(hào)分別為DQ452397(PLK)、DQ452398(PNPO)。本研究獲得的PLK-cDNA含有-894 bp的完整可讀框，編碼一條分子量為33.1 kDa，含298個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。此蛋白質(zhì)與人的PL

6、K序列同一性為52.84％，包含吡哆醛激酶共有的特征保守序列，但其氨基酸殘基數(shù)比哺乳動(dòng)物和植物克隆到的吡哆醛激酶殘基數(shù)均少10多個(gè)殘基。本研究獲得的PNPO-cDNA含有-771 bp的完整閱讀框，編碼一條分子量為29.86 kDa，含257個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。此蛋白質(zhì)與人的PNPO序列同一性為51.44％，一些PNPO中保守性殘基也存在于此蛋白中。在人和大腸桿菌PNPO中的幾個(gè)具有重要作用的氨基酸殘基在此蛋白質(zhì)中被其他殘基替換。克隆

7、到的兩條cDNA的ORF框分別連接入pET22b(+)構(gòu)建重組表達(dá)載體，表達(dá)載體轉(zhuǎn)入E．coli BL21(DE3)中，菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后，高效表達(dá)出了預(yù)期分子量大小的非融合蛋白。對(duì)表達(dá)產(chǎn)物粗酶液進(jìn)行了酶促反應(yīng)，采用衍生化熒光檢測(cè)法檢測(cè)酶促反應(yīng)產(chǎn)物PLP的生成量。首次采用PLK與PNPO雙酶級(jí)聯(lián)檢測(cè)PNPO酶活?；钚詸z測(cè)結(jié)果顯示，PLK-cDNA的表達(dá)產(chǎn)物粗酶液具有活力為30 nmol/min/mg的吡哆醛激酶活性，PNPO-cD

8、NA的表達(dá)產(chǎn)物粗酶液具有活力為17 nmol/min/mg的磷酸吡哆醇氧化酶活性。酶活實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了克隆到的兩條cDNA分別編碼家蠶中吡哆醛激酶和磷酸吡哆醇氧化酶。 依據(jù)家蠶基因組數(shù)據(jù)庫信息和PLK、PNPO的cDNA，獲得了家蠶中PLK和PNPO基因區(qū)序列。家蠶PLK基因包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，跨越10 kb DNA序列。家蠶PNPO基因同樣包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，跨越3.5 kb DNA序列。家蠶PLK和PNPO基因