酪氨酸酶siRNA有效抑制小鼠酪氨酸酶基因表達的初步研究.pdf

1、目的： 通過RNAi技術(shù)，體外篩選出針對小鼠酪氨酸酶的有效siRNA，并利用篩選出的優(yōu)勢片段進行C57BL/6小鼠的體內(nèi)實驗，檢測體內(nèi)片段的干擾效率，以此探討針對小鼠酪氨酸酶的siRNA在體內(nèi)發(fā)揮RNAi作用的可行性，并進一步為酪氨酸酶異常等人類疾病的動物模型制作及該類疾病的預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.利用針對小鼠酪氨酸酶mRNA的不同干擾片段分別轉(zhuǎn)染小鼠黑色素瘤B16細胞系，同時采用陰性干擾片段轉(zhuǎn)染作為陰

2、性對照，單純脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染作為空白對照。使用實時熒光定量PCR、酪氨酸酶活性測定和黑色素含量測定三種方法分三個時間點于轉(zhuǎn)染后24小時、48小時、72小時對不同組的細胞干擾結(jié)果進行檢測。 2.使用實時熒光定量PCR的方法檢測該優(yōu)勢片段體內(nèi)干擾作用的可行性。利用體外篩選出的優(yōu)勢片段siNM_011661_001片段進行C57BL/6小鼠的體內(nèi)實驗，采用不同濃度的針對C57BL/6小鼠酪氨酸酶的優(yōu)勢片段siRNA進行RNAi的體內(nèi)實驗，該

3、實驗采用玻璃體腔注射的方法進行。24小時后于基因水平檢測該片段對小鼠視網(wǎng)膜酪氨酸酶的干擾效率。 結(jié)果： 1.siNM_011661_001、siNM_011661_002、siNM_011661_003三個干擾片段均能在轉(zhuǎn)染后發(fā)揮一定的干擾作用，其中siNM_011661_001在轉(zhuǎn)染后發(fā)揮的干擾效果最強，在降低酪氨酸酶基因mRNA表達、酶活性、以及黑素含量三方面分別能起到82.81％、64.73％、52.53％的抑制作

4、用。 2.玻璃體腔注射后siNM_011661_001片段后24小時，提取的視網(wǎng)膜mRNA進行檢測。結(jié)果顯示0.65nmol siNM_011661_001處理組與1.3nmolsiNM_011661_001處理組小鼠視網(wǎng)膜酪氨酸酶mRNA較僅用PBS處理過的小鼠的視網(wǎng)膜分別降低25.18％，60.80％。 結(jié)論： 針對小鼠酪氨酸酶的siNM_011661_001序列能在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮高效、穩(wěn)定的基因沉默作用，是