B型排斥性導(dǎo)向分子在肺癌中的表達(dá)與預(yù)后研究.pdf

1、腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是其惡性表現(xiàn)最基本的特征，同時(shí)這也是影響患者預(yù)后最主要的因素。近年來(lái)，肺癌的發(fā)病率逐年提高，現(xiàn)已經(jīng)成為最為高發(fā)的腫瘤之一，其也位居腫瘤相關(guān)性致死率方面的首位。目前，對(duì)于早期的肺癌患者來(lái)說(shuō)，根治性手術(shù)切除仍然是首選的治療方式。盡早發(fā)現(xiàn)盡早治療，可以明顯提高患者的預(yù)后水平和生活質(zhì)量。然而，大多數(shù)患者在診斷疾病時(shí)已處于中晚期，治療方式主要以放化療手段為主。即便有些患者術(shù)后診斷為早期肺癌，但部分仍有可能出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。當(dāng)前，由于

2、肺癌早期階段的發(fā)生發(fā)展較為隱匿，同時(shí)缺乏特異性的篩查指標(biāo)和預(yù)防措施，有些患者即便接受手術(shù)或者放化療，其預(yù)后仍然不理想。因此，了解肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制并進(jìn)一步探索其生物學(xué)特性從而顯得至關(guān)重要。
　　B型排斥性導(dǎo)向分子(Repulsive guidance molecules B，RGMB)是排斥性導(dǎo)向分子(RGMs)家族的成員之一。先前已有研究表明在乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌中，RGMB的表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有一定的相關(guān)性。但在

3、肺癌中仍少見相關(guān)報(bào)道。另外，RGMB作為骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)的共表達(dá)受體，其是否會(huì)參與并調(diào)控BMPs信號(hào)通路仍然未知。前期有研究顯示，RGMs可改變腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，抑制其侵襲轉(zhuǎn)移的能力。本研究的目的旨在研究RGMB在肺癌中的表達(dá)情況和其相關(guān)的生物學(xué)行為。
　　目的：
　　本課題首先通過(guò)搜索TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫(kù)

4、搜集肺癌組織中RGMB的表達(dá)情況，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析表達(dá)的相關(guān)性。進(jìn)一步通過(guò)RT-PCR(real-time polymerase chain reaction)檢測(cè)了本院120例肺癌組織和30例正常肺組織中RGMB基因的表達(dá)情況，分析RGMB基因表達(dá)水平與患者臨床指標(biāo)及疾病預(yù)后的相關(guān)性。同時(shí)，檢測(cè)對(duì)不同肺癌細(xì)胞株進(jìn)行RGMB基因表達(dá)水平的檢測(cè)，篩選出高表達(dá)的細(xì)胞株并構(gòu)建穩(wěn)定的RGMB基因敲除細(xì)胞模型，為下一步驗(yàn)證其對(duì)腫瘤細(xì)胞功能的影響

5、和通路研究做進(jìn)一步準(zhǔn)備。
　　方法：
　　1.對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，研究RGMB表達(dá)情況與肺癌的相關(guān)性。
　　2.對(duì)臨床正常肺組織和肺癌組織標(biāo)本中RGMB基因的表達(dá)量應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測(cè)，前瞻性分析RGMB表達(dá)水平與臨床病理、分期及預(yù)后的關(guān)系。
　　3.對(duì)高表達(dá)RGMB基因的肺癌細(xì)胞株進(jìn)行篩選，使用熒光定量PCR對(duì)多種肺癌細(xì)胞株進(jìn)行RGMB mRNA的檢測(cè)，從而進(jìn)一步篩選出RGMB基因處于高表達(dá)的肺癌細(xì)

6、胞株，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)作進(jìn)一步準(zhǔn)備。
　　4.pLVX-shRNA-Puro-RGMB真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其鑒定利用國(guó)際上公認(rèn)的引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站設(shè)計(jì)及篩選相關(guān)序列，交由生物公司進(jìn)行合成。將所設(shè)計(jì)的引物與pLVX-Puro質(zhì)粒重組之后，同時(shí)制備感受態(tài)的大腸桿菌，對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)染，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行陽(yáng)性克隆的鑒定，并提取質(zhì)粒;再利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞株，對(duì)其轉(zhuǎn)染干擾效率應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)進(jìn)行檢測(cè)，將高干擾效率片段篩選出后并進(jìn)行慢病毒包裝和后續(xù)實(shí)

7、驗(yàn)。
　　5.慢病毒LV-RGMB-scramble和LV-RGMB-shRNA的制備，感染A549細(xì)胞株
　　在293T細(xì)胞中進(jìn)行慢病毒的包裝、收集及滴度測(cè)定，進(jìn)一步使用該病毒感染篩選出的高表達(dá)RGMB的肺癌細(xì)胞株A549，利用嘌呤霉素進(jìn)行穩(wěn)定篩選和培養(yǎng)，從而獲得RGMB基因穩(wěn)定敲除的肺癌細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染效率利用mRNA的測(cè)定進(jìn)行判定，分別從蛋白及基因及水平利用western blot法和熒光定量PCR對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中RGMB的

8、表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。
　　6.沉默RGMB基因?qū)Ψ伟〢549細(xì)胞功能的影響
　　利用MTT實(shí)驗(yàn)(methyl thiazolyl tetrazolium test)根據(jù)細(xì)胞存活率來(lái)描述細(xì)胞的生長(zhǎng)情況;利用細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)觀察其黏附能力;對(duì)細(xì)胞的遷移及侵襲能力的測(cè)定則利用劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)行觀察。
　　7、利用Western blot對(duì)RGMB表達(dá)降低的細(xì)胞株中BMPs信號(hào)通路蛋白分子表達(dá)的檢

9、測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中肺癌RGMB表達(dá)情況的分析得出，RGMB基因在腫瘤組織中下調(diào)，并且與T和N分期具有顯著的負(fù)相關(guān)性。在男性患者中表達(dá)較低。
　　2.進(jìn)一步對(duì)本院肺癌標(biāo)本進(jìn)行研究，對(duì)RGMB的基因表達(dá)水平應(yīng)用RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常肺組織相比，肺癌組織中RGMB基因表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05）。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)女性患者含有的RGMB表達(dá)水平相對(duì)較高。肺癌晚期人群RGMB表達(dá)水平較低

10、，而早期人群RGMB水平高表達(dá)(P＜0.05)。結(jié)果提示RGMB高表達(dá)與較好的臨床預(yù)后和生存狀態(tài)相關(guān)。
　　3.成功篩選出了肺癌細(xì)胞株A549為高表達(dá)RGMB基因的細(xì)胞株。并成功構(gòu)建針對(duì)RGMB基因的RNAi真核質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，將所得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，RT-PCR結(jié)果提示該質(zhì)?？梢援a(chǎn)生理想的干擾效果。
　　4、成功包裝了慢病毒LV-RGMB-scramble、LV-RGMB-shRNA，進(jìn)一步將其感染A549肺癌細(xì)

11、胞株，經(jīng)嘌呤霉素進(jìn)行篩選后，結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)組A549細(xì)胞RGMB的mRNA的表達(dá)比未處理細(xì)胞下降約65％(p＜0.05)。表明已成功構(gòu)建RGMB基因穩(wěn)定敲除的肺癌細(xì)胞株。
　　5、A549RGMB基因穩(wěn)定沉默肺癌細(xì)胞株體外增殖能力、黏附、遷移和侵襲能力與對(duì)照組相比明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。
　　6、為了研究RGMB是否參與BMP的信號(hào)通路，利用RGMB穩(wěn)定沉默和對(duì)照組A549細(xì)胞株進(jìn)行研究。用Western blot檢測(cè)BMP

12、s信號(hào)通路中蛋白分子，發(fā)現(xiàn)RGMB沉默后Smad-1/5/8磷酸化水平上升(p＜0.05);然而ERK和JNK蛋白的活化水平兩組間未見明顯改變。該結(jié)果認(rèn)為RGMB可能是通過(guò)抑制Smad1/5/8通路來(lái)發(fā)揮抑制腫瘤的作用。
　　結(jié)論：
　　1、成功構(gòu)建了針對(duì)RGMB基因的慢病毒干擾載體，對(duì)肺癌細(xì)胞A549中RGMB基因的表達(dá)狀態(tài)可持續(xù)穩(wěn)定的發(fā)揮抑制作用。
　　2、沉默RGMB基因的表達(dá)能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移等