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文檔簡介
1、NG-18(N-(2-ethoxyethyl)gambogamide)是由中科院上海藥物研究所段文虎課題研究組對藤黃中的有效成分藤黃酸(gambogic acid,GA)結構修飾而得到的新化合物。本研究首先評價該化合物體外抗腫瘤活性,進而對其誘導HL-60細胞凋亡作用機制進行初步探討。 體外抑制細胞增殖實驗中,懸浮細胞我們采用四氮唑鹽還原法(3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyl te
2、trazolium bromide,MTT),貼壁細胞采用磺酰羅丹明B蛋白染色法(Sulforhodamine B,SRB)來觀察NG-18對19株腫瘤細胞(包括2株白血病,2株肺癌,3株胃癌,3株結腸癌,3株乳腺癌,2株卵巢癌,1株宮頸癌和3株肝癌)體外增殖抑制作用。結果顯示NG-18對這些腫瘤細胞均有顯著地增殖抑制作用,具有廣泛的細胞毒作用。NG-18和母核GA的平均IC<,50>值分別為0.86μM和1.24μM,因此NG-18的
3、體外抗腫瘤能力要高于其母核GA。 接著,我們在人白血病細胞HL-60上運用PI染色一流式細胞分析、Annexin V-FITC結合實驗、DNA片段化電泳分析等方法來觀察NG-18對HL-60細胞凋亡和細胞周期的影響。結果表明NG-18有很強的誘導細胞發(fā)生凋亡的作用,并且呈時間和劑量依賴性。通過流式細胞分析,我們可以發(fā)現0.5 μM NG-18作用6 h和1 μM NG-18作用3 h,就能發(fā)生明顯的細胞凋亡。DNA片段化電泳分析
4、結果顯示,0.5μNG-18作用6 h后,出現了明顯的DNA梯狀條紋,表明細胞發(fā)生了凋亡。但是NG-18在誘導HL-60細胞凋亡的過程中并沒有影響其細胞周期的分布。 我們對NG-18誘導HL-60細胞凋亡的機制進行了初步的探討。首先我們用堿性單細胞凝膠電泳來檢測細胞凋亡早期,細胞核DNA是否發(fā)生了斷裂。結果表明NG-18并非是通過誘導細胞核DNA發(fā)生斷裂而引發(fā)細胞凋亡。在凋亡程序的啟動及執(zhí)行過程中,有一大類蛋白酶家族Caspas
5、es起著十分重要的作用。Caspases(Cystein-containing,aspartat-specificproteases)的本質是一類半胱氨酸蛋白酶,在正常的狀態(tài)下,它們以無活性的酶原(proenzymes)形式存在。 用Western Blot的方法我們發(fā)現,在NG-18誘導HL-60細胞凋亡的過程中,胞外和胞內兩條凋亡信號通路上的啟動Caspases,Caspase-8和Caspase-9幾乎能同時被激活。這一結
6、果表明胞外和胞內兩條凋亡途徑都參與了NG-18誘導的HL-60細胞凋亡。接著,我們預先用Caspases泛抑制劑(Z-VAD-FMK)處理細胞,再加入NG-18,結果顯示Z-VAD-FMK能夠完全抑制NG-18誘導的細胞凋亡。我們用其它的Caspases抑制劑如Caspase-2抑制劑(Z-VDVAD-FMK)、Caspase-9抑制劑(Z-LEHD-FMK)和Caspase-8抑制劑(Z-IETD-FMK)相同的方法處理細胞,結果表明
7、只有Caspase-8抑制劑(Z-IETD-FMK)才能大部分抑制NG-18誘導的細胞凋亡,抑制效果約為66.7%。以上結果提示,NG-18誘導細胞凋亡是依賴于Caspases途徑,并且在此凋亡過程中,Caspase-8處于中心地位,起著關鍵性的作用。綜合以上結果,我們得出以下結論:雖然胞外和胞內兩條凋亡途徑都參與了NG-18誘導的HL-60細胞凋亡,但是胞外途徑是主要的凋亡途徑。在NG-18誘導HL-60細胞凋亡的過程中,Bcl-2家
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